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zoulong312

木虫 (小有名气)

[交流] T4连接酶连接问题 已有4人参与

TaKaRa T4 ligase 50µL连接体系过夜连接150ng外源片段和200ng载体后,加入1/10体积的3M 醋酸钠(pH5.2),混匀后,加入2.5倍体积的冷无水乙醇,-20℃静置6个小时后,12000rpm离心10后,没有看见沉淀正常吗?实验室有师兄说他的可以看见沉淀,不知道是不是我实验中出现了什么问题。请牛人指点迷津。
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Dragon
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果子么么茶

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
看不见不代表没有 可以跑胶看一下啊
2楼2012-04-20 21:10:31
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zoulong312

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-04-20 21:10:31:
看不见不代表没有 可以跑胶看一下啊

我是要用来建库的,所以要求量比较大,做过转化可是库容量不是很高。所以担心是不是沉淀的时候损失了较多的DNA
Dragon
3楼2012-04-20 21:42:54
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酶切专家

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
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西瓜: 金币+2, Good! 2012-04-20 23:04:53
如果是建库,用来做连接的载体和外源片段都应该在ug水平,而不是才100-200ng.而且可以直接用PCR快纯试剂盒进行回收(最后用水洗脱,方便电转)
4楼2012-04-20 22:42:26
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piggpi

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
乙醇沉淀回收和试剂盒回收都会有一定的损失的,没有说哪个一定好。另外,乙醇沉淀离心后真能看到稍透明的沉淀说明提取回收质量很好,看不到也不见得就少,至少我回收后没看到过,但加水溶解后鉴定浓度也是可以的,所以放心吧。建库的话取1.0-2.0ug足够打断建库。
在很久很久以前
5楼2012-04-20 23:31:21
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zoulong312

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-04-20 22:42:26:
如果是建库,用来做连接的载体和外源片段都应该在ug水平,而不是才100-200ng.而且可以直接用PCR快纯试剂盒进行回收(最后用水洗脱,方便电转)

我一般同时连好几支,只是每一支的体系就是那么大,但心体系太大会出现什么问题。
Dragon
6楼2012-04-21 09:23:13
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zoulong312

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by piggpi at 2012-04-20 23:31:21:
乙醇沉淀回收和试剂盒回收都会有一定的损失的,没有说哪个一定好。另外,乙醇沉淀离心后真能看到稍透明的沉淀说明提取回收质量很好,看不到也不见得就少,至少我回收后没看到过,但加水溶解后鉴定浓度也是可以的, ...

3Q,我下次也测一下浓度试试看。
Dragon
7楼2012-04-21 09:25:02
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lxh502976898

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你可以试一下DNAmate核酸共沉淀试剂 http://www.takara.com.cn/?action ... =164&subclass=1
8楼2012-08-21 09:47:25
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