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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T4连接酶连接问题
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zoulong312

木虫 (小有名气)

[交流] T4连接酶连接问题 已有4人参与

TaKaRa T4 ligase 50µL连接体系过夜连接150ng外源片段和200ng载体后，加入1/10体积的3M 醋酸钠（pH5.2），混匀后，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃静置6个小时后，12000rpm离心10后，没有看见沉淀正常吗？实验室有师兄说他的可以看见沉淀，不知道是不是我实验中出现了什么问题。请牛人指点迷津。
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Dragon
1楼 2012-04-20 20:10:50
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果子么么茶

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看不见不代表没有 可以跑胶看一下啊
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2楼2012-04-20 21:10:31
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zoulong312

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-04-20 21:10:31:
看不见不代表没有 可以跑胶看一下啊

我是要用来建库的，所以要求量比较大，做过转化可是库容量不是很高。所以担心是不是沉淀的时候损失了较多的DNA
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Dragon
3楼2012-04-20 21:42:54
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西瓜: 金币+2, Good！ 2012-04-20 23:04:53
如果是建库，用来做连接的载体和外源片段都应该在ug水平，而不是才100-200ng.而且可以直接用PCR快纯试剂盒进行回收（最后用水洗脱，方便电转）
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4楼2012-04-20 22:42:26
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piggpi

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
乙醇沉淀回收和试剂盒回收都会有一定的损失的，没有说哪个一定好。另外，乙醇沉淀离心后真能看到稍透明的沉淀说明提取回收质量很好，看不到也不见得就少，至少我回收后没看到过，但加水溶解后鉴定浓度也是可以的，所以放心吧。建库的话取1.0-2.0ug足够打断建库。
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在很久很久以前
5楼2012-04-20 23:31:21
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zoulong312

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-04-20 22:42:26:
如果是建库，用来做连接的载体和外源片段都应该在ug水平，而不是才100-200ng.而且可以直接用PCR快纯试剂盒进行回收（最后用水洗脱，方便电转）

我一般同时连好几支，只是每一支的体系就是那么大，但心体系太大会出现什么问题。
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Dragon
6楼2012-04-21 09:23:13
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zoulong312

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by piggpi at 2012-04-20 23:31:21:
乙醇沉淀回收和试剂盒回收都会有一定的损失的，没有说哪个一定好。另外，乙醇沉淀离心后真能看到稍透明的沉淀说明提取回收质量很好，看不到也不见得就少，至少我回收后没看到过，但加水溶解后鉴定浓度也是可以的， ...

3Q，我下次也测一下浓度试试看。
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Dragon
7楼2012-04-21 09:25:02
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你可以试一下DNAmate核酸共沉淀试剂 http://www.takara.com.cn/?action ... =164&subclass=1
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8楼2012-08-21 09:47:25
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