应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】聚乙二醇在连接反应中的作用
191/2返回列表12下一页
查看: 2705  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wangdandelia

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】聚乙二醇在连接反应中的作用 已有4人参与

大家有没有在平末端连接反应体系中加入过聚乙二醇8000呢？
效果好不好啊？
应该加入多少聚乙二醇呢？
对后续的转化有没有影响？
我的是T4DNA连接酶，连接质粒载体和小DNA片段。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-12-30 17:12:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-30 17:45:15:



平端连接对底物浓度及酶的浓度要求比较高，可以用NEB或者Promega的连接酶，TaKaRa的T4就算了。

恩，我是用的NEB的T4连接酶。
能说具体一点吗？到底酶和DNA需要多高浓度呢？谢谢了！

[ Last edited by wangdandelia on 2010-12-30 at 17:57 ]
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2010-12-30 17:55:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+1):谢谢分享 2010-12-30 17:51:45
连接酶我现在都用那种预混好的mix
就是酶和buffer预混在一起的，直接加入到质粒和片段的混合液就好了~

没试过聚乙二醇
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-12-30 17:17:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-30 17:17:03:
连接酶我现在都用那种预混好的mix
就是酶和buffer预混在一起的，直接加入到质粒和片段的混合液就好了~

没试过聚乙二醇

请问你用的是哪个公司的mix啊？连接平末端效率怎样？
赞一下 回复此楼
3楼2010-12-30 17:42:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+1):谢谢分享 2010-12-30 17:52:02
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 17:42:20:

请问你用的是哪个公司的mix啊？连接平末端效率怎样？

平端连接对底物浓度及酶的浓度要求比较高，可以用NEB或者Promega的连接酶，TaKaRa的T4就算了。
赞一下(2人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2010-12-30 17:45:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kun2199

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
好像主要是增加连接体系内的拥挤程度，增加载体和片段的碰撞几率，用过两次，没起到效果，Takala的T4连接酶可以连接平端，我连过3k片段加8k的载体，不加水，10ul小体系，片段亮度要大。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-12-30 18:08:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 17:55:47:

恩，我是用的NEB的T4连接酶。
能说具体一点吗？到底酶和DNA需要多高浓度呢？谢谢了！

[ Last edited by wangdandelia on 2010-12-30 at 17:57 ]

10ul的体系，加1uL的酶，除过buffer，剩下的都加载体和DNA。

小片段的连接要时间长。当初我们实验室一个老师做启动子连接，连了好几次没成功，后来又做了一次，结果这次碰上了搬家。一周过后想起来了，抱着试试看的心态转了一次，结果长了好多。
赞一下(1人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2010-12-30 19:49:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-30 19:49:05:



10ul的体系，加1uL的酶，除过buffer，剩下的都加载体和DNA。

小片段的连接要时间长。当初我们实验室一个老师做启动子连接，连了好几次没成功，后来又做了一次，结果这次碰上了搬家。一周过后想起来了，抱 ...

哦，好的，谢谢哦~
呵呵，那你们的连接条件是多少度呢？连接多长时间？还有载体与短片段DNA的比例是大约多少？
莫怪我问题多呀，O(∩_∩)O~
赞一下 回复此楼
8楼2010-12-30 20:38:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 20:38:05:

哦，好的，谢谢哦~
呵呵，那你们的连接条件是多少度呢？连接多长时间？还有载体与短片段DNA的比例是大约多少？
莫怪我问题多呀，O(∩_∩)O~

如果你想过夜连的话可以在16度，如果想更久的话就放在4度。我们一般就在16度过夜，做不出来才考虑长时间4度连接。

外源DNA与载体DNA的摩尔比为10：1，记得是摩尔比哈，不是质量比。这个比例还可以加大。
赞一下(1人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2010-12-30 20:40:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
不要误导到别人了，是说很小的片段平端连接的时候可以这样的比例。一般情况3：1就可以了。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
10楼2010-12-30 20:43:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wangdandelia 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 5个%2F，非固定段22个字母 +9 jaasxulu 2026-07-15 10/500 2026-07-19 18:58 by wowsunflower
[基金申请] 小木虫没落了，除了祈祷帖子，几乎看不到有价值的帖子 +15 botar 2026-07-14 16/800 2026-07-19 18:23 by wowsunflower
[硕博家园] 售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急 +3 bjm2e4yior 2026-07-18 3/150 2026-07-19 16:43 by 0u3sh5hhfi
[论文投稿] 售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急 +3 ufgqpyvpi6 2026-07-18 6/300 2026-07-19 16:23 by 0u3sh5hhfi
[考博] 售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急 +3 ufgqpyvpi6 2026-07-18 4/200 2026-07-19 16:10 by 0u3sh5hhfi
[教师之家] 售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急 +3 ufgqpyvpi6 2026-07-18 6/300 2026-07-19 16:03 by 0u3sh5hhfi
[考研] 售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急 +3 ufgqpyvpi6 2026-07-18 6/300 2026-07-19 16:03 by 0u3sh5hhfi
[基金申请] 国社科通讯评审 +5 潜水冠军123 2026-07-18 6/300 2026-07-19 12:28 by lfy8008
[基金申请] 面上的水很深 +16 布布和一二 2026-07-18 21/1050 2026-07-19 10:07 by Vivilian
[基金申请] 生命口C13面上会评时间 +7 luckinging 2026-07-14 11/550 2026-07-17 20:43 by 虫卜1988
[基金申请] 生命口面上会评结束了吗大家有知道结果吗？现在还没有结果正常不？ +6 碧水00 2026-07-16 9/450 2026-07-17 15:21 by jaasxulu
[有机交流] 伯胺上甲基求助 100+4 002tmumu 2026-07-14 7/350 2026-07-16 19:47 by 002tmumu
[论文投稿] 跨出版社商投稿 20+5 倪好520 2026-07-13 5/250 2026-07-16 17:24 by 无视军团
[基金申请] 生生命学部会评 +4 wuke100666 2026-07-15 4/200 2026-07-16 00:12 by 啦啦小妮子
[基金申请] H口，面上，时间戳7月7日。 +3 plumage5 2026-07-15 3/150 2026-07-15 21:06 by 6543yes
[基金申请] 会评 +5 无名者登山 2026-07-15 5/250 2026-07-15 18:15 by 杠就是你对
[基金申请] E口会评 +11 布布和一二 2026-07-13 13/650 2026-07-15 16:34 by Kittylucky
[基金申请] E口青C会评结束了吗？ 40+3 小小书虫c 2026-07-14 9/450 2026-07-15 16:04 by 安静的知了
[论文投稿] 农业机械学报投稿周期 +3 G0DLIN 2026-07-14 7/350 2026-07-15 09:26 by xs74101122
[基金申请] 没收到消息，再次陪跑 +3 天空星辰fly 2026-07-14 3/150 2026-07-14 19:14 by 6543yes
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭