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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】聚乙二醇在连接反应中的作用
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】聚乙二醇在连接反应中的作用 已有4人参与

大家有没有在平末端连接反应体系中加入过聚乙二醇8000呢？
效果好不好啊？
应该加入多少聚乙二醇呢？
对后续的转化有没有影响？
我的是T4DNA连接酶，连接质粒载体和小DNA片段。
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1楼 2010-12-30 17:12:14
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
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Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-30 17:45:15:



平端连接对底物浓度及酶的浓度要求比较高，可以用NEB或者Promega的连接酶，TaKaRa的T4就算了。

恩，我是用的NEB的T4连接酶。
能说具体一点吗？到底酶和DNA需要多高浓度呢？谢谢了！

[ Last edited by wangdandelia on 2010-12-30 at 17:57 ]
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5楼2010-12-30 17:55:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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reasonspare(金币+1):谢谢分享 2010-12-30 17:51:45
连接酶我现在都用那种预混好的mix
就是酶和buffer预混在一起的，直接加入到质粒和片段的混合液就好了~

没试过聚乙二醇
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2楼2010-12-30 17:17:03
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-30 17:17:03:
连接酶我现在都用那种预混好的mix
就是酶和buffer预混在一起的，直接加入到质粒和片段的混合液就好了~

没试过聚乙二醇

请问你用的是哪个公司的mix啊？连接平末端效率怎样？
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3楼2010-12-30 17:42:20
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 17:42:20:

请问你用的是哪个公司的mix啊？连接平末端效率怎样？

平端连接对底物浓度及酶的浓度要求比较高，可以用NEB或者Promega的连接酶，TaKaRa的T4就算了。
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4楼2010-12-30 17:45:15
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kun2199

金虫 (小有名气)
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好像主要是增加连接体系内的拥挤程度，增加载体和片段的碰撞几率，用过两次，没起到效果，Takala的T4连接酶可以连接平端，我连过3k片段加8k的载体，不加水，10ul小体系，片段亮度要大。
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6楼2010-12-30 18:08:25
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brightfuture01

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Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 17:55:47:

恩，我是用的NEB的T4连接酶。
能说具体一点吗？到底酶和DNA需要多高浓度呢？谢谢了！

[ Last edited by wangdandelia on 2010-12-30 at 17:57 ]

10ul的体系，加1uL的酶，除过buffer，剩下的都加载体和DNA。

小片段的连接要时间长。当初我们实验室一个老师做启动子连接，连了好几次没成功，后来又做了一次，结果这次碰上了搬家。一周过后想起来了，抱着试试看的心态转了一次，结果长了好多。
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7楼2010-12-30 19:49:05
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
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Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-30 19:49:05:



10ul的体系，加1uL的酶，除过buffer，剩下的都加载体和DNA。

小片段的连接要时间长。当初我们实验室一个老师做启动子连接，连了好几次没成功，后来又做了一次，结果这次碰上了搬家。一周过后想起来了，抱 ...

哦，好的，谢谢哦~
呵呵，那你们的连接条件是多少度呢？连接多长时间？还有载体与短片段DNA的比例是大约多少？
莫怪我问题多呀，O(∩_∩)O~
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8楼2010-12-30 20:38:05
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brightfuture01

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Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 20:38:05:

哦，好的，谢谢哦~
呵呵，那你们的连接条件是多少度呢？连接多长时间？还有载体与短片段DNA的比例是大约多少？
莫怪我问题多呀，O(∩_∩)O~

如果你想过夜连的话可以在16度，如果想更久的话就放在4度。我们一般就在16度过夜，做不出来才考虑长时间4度连接。

外源DNA与载体DNA的摩尔比为10：1，记得是摩尔比哈，不是质量比。这个比例还可以加大。
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9楼2010-12-30 20:40:48
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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不要误导到别人了，是说很小的片段平端连接的时候可以这样的比例。一般情况3：1就可以了。
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10楼2010-12-30 20:43:00
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