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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】聚乙二醇在连接反应中的作用
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
晕死，机子卡了，发了两遍。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
11楼2010-12-30 20:43:21
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
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Originally posted by kun2199 at 2010-12-30 18:08:25:
好像主要是增加连接体系内的拥挤程度，增加载体和片段的碰撞几率，用过两次，没起到效果，Takala的T4连接酶可以连接平端，我连过3k片段加8k的载体，不加水，10ul小体系，片段亮度要大。

(⊙v⊙)嗯，好的，谢谢哦~
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12楼2010-12-30 20:43:46
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-30 20:40:48:



如果你想过夜连的话可以在16度，如果想更久的话就放在4度。我们一般就在16度过夜，做不出来才考虑长时间4度连接。

外源DNA与载体DNA的摩尔比为10：1，记得是摩尔比哈，不是质量比。这个比例还可以加大。

恩，好的，我也试试，呵呵，非常感谢~！新年快乐！
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13楼2010-12-30 20:45:40
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-30 20:43:21:
晕死，机子卡了，发了两遍。

忘了问了，呵呵，你们加PEG8000吗？
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14楼2010-12-30 20:47:35
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 20:47:35:

忘了问了，呵呵，你们加PEG8000吗？

不加的，呵呵，想加的话你加点吧。这个的作用是亲水，然后增加片段的相对浓度，有利于分子碰撞，增大连上的可能性。
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15楼2010-12-30 20:50:34
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-30 20:50:34:



不加的，呵呵，想加的话你加点吧。这个的作用是亲水，然后增加片段的相对浓度，有利于分子碰撞，增大连上的可能性。

哦，请问加上PEG之后，会不会影响转化呢？
很多人说加入PEG后也不一定起作用，可能还要提纯。。
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16楼2010-12-30 20:52:37
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 20:52:37:

哦，请问加上PEG之后，会不会影响转化呢？
很多人说加入PEG后也不一定起作用，可能还要提纯。。

高浓度的会对转化造成不利。提纯的话就算了，乙醇沉淀会损失好些DNA的，更何况你这么少的连接产物。

实在相加的话就加不同比例的试试，看看下面这篇文献：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ ... f/nar00367-0201.pdf
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17楼2010-12-30 20:58:56
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by wangdandelia at 2010-12-30 17:42:20:

请问你用的是哪个公司的mix啊？连接平末端效率怎样？

我用TOYOBO的。效率真的没话说~~没想到一个日系的小公司还挺给力
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18楼2010-12-30 21:34:44
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-30 21:34:44:


我用TOYOBO的。效率真的没话说~~没想到一个日系的小公司还挺给力

(⊙o⊙)哦 有机会的话试一试，谢谢哦~呵呵~
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19楼2010-12-30 21:48:49
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