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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生

[求助] 使用T4连接酶的问题

使用T4 DNA 连接酶连接的产物,可以直接转化吗?


25微升体系如何确定?
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励积极应助! 2011-11-14 19:33:11
可以的,25微升体系:1ul T4 ligase,2.5ul 10*buffer,其余就是载体酶切产物和基因酶切产物了,两者的体积比根据浓度来调整的。
2楼2011-11-14 17:55:39
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zyly605

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
amisking(金币+4): 鼓励积极应助! 2011-11-14 19:33:19
连接产物直接转化。连接在4℃或16℃过夜(具体视载体和目的基因而定)
5ul的连接体系即足够:T4 buffer 1ul,T4连接酶 1ul,片段:载体=10:1(摩尔比),水补足5ul。连接效率挺高的
3楼2011-11-14 19:19:23
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助回帖! 2011-11-15 17:37:10
加感受态时,体积应至少为连接体系的5倍左右,25ul体系偏大些,建议10ul体系或是上面的同学提到的5ul体系即可。
jiayoubashaonian
4楼2011-11-14 21:49:16
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芥末猫

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3927046楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-14 21:49:16
加感受态时,体积应至少为连接体系的5倍左右,25ul体系偏大些,建议10ul体系或是上面的同学提到的5ul体系即可。

你好 能问下为什么加感受态时,体积应至少为连接体系的5倍左右??连接体系对后续实验有什么影响吗??  谢谢
5楼2012-07-16 17:25:13
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