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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 咨询个基因重组实验中问题
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yuliansheng

金虫 (小有名气)

[求助] 咨询个基因重组实验中问题

各位高手们，
                 咨询大家个问题，基因重组实验中有一步是给切好的质粒载体用碱性磷酸酶去磷酸化，之后再用连接酶连接目的基因片段和质粒载体。请问，这步中如果把去磷酸化的质粒载体再用连接酶连接，是否可以在连接上？如果不可以，那为什么能把质粒载体和目的基因片段连接上？

[ Last edited by yuliansheng on 2011-4-27 at 12:46 ]
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学习....
1楼 2011-04-27 12:44:50
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xuguanghai

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yuliansheng(金币+1): 说的太好、太详细了，谢谢，真的很感谢！ 2011-04-27 20:48:46
西瓜(金币+3): Good!可惜不是原创，离EPI差一点。 2011-04-27 21:35:45
常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
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2楼2011-04-27 13:51:25
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yuliansheng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xuguanghai at 2011-04-27 13:51:25:
常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（ ...

高手啊！
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学习....
3楼2011-04-27 20:50:54
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-05-19 12:45:14
去磷酸化时有一个问题，好像5‘端突出和3’端突出需要不同的处理手段。
但是，
酶切后5‘端突出和3’端突出分别是什么意思啊？
例如EcoR I，识别位点为
G'AATTC
CAATT'G
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微生物发酵
4楼2011-05-19 09:15:09
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eileen8519

金虫 (小有名气)
新手，搞不懂，学习中。
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5楼2011-10-13 12:02:49
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