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wangdongadd

新虫 (小有名气)

[求助] 克隆方面的问题

我的样品先经过DGGE然后切胶回收,后用试剂盒进行了纯化,请问在做克隆连接时还需要加A吗?16度连接过夜可以吗?做阳性质粒对照和阴性对照时也需要连接这一步吗?还是转化的时候再在感受态加入质粒和无菌水?加多少呢?谢谢!
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gyesang

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wangdongadd(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩,gy版热心肠 2013-07-26 08:54:58
1. 你连的是什么载体,T载体还是T-blunt载体,如果是T载体,回收产物需不需要加A,取决于你用的什么类型DNA聚合酶,如果是高保真酶,那就需要加A,如果是Taq酶扩增的,就不需要再加A

2. 普通的T4 DNA Ligase一般需要16度连接过夜

3. 阳性质粒转化,主要是验证感受态细胞,平板抗性,阴性对照主要是验证载体自连,T载体用不着阴性对照
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-07-25 22:51:05
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wangdongadd

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-25 22:51:05
1. 你连的是什么载体,T载体还是T-blunt载体,如果是T载体,回收产物需不需要加A,取决于你用的什么类型DNA聚合酶,如果是高保真酶,那就需要加A,如果是Taq酶扩增的,就不需要再加A

2. 普通的T4 DNA Ligase一般 ...

太到位了,谢谢。
3楼2013-07-26 14:42:00
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
链接酶的话也可以考虑4度连,因为它比较容易失活,16度有危险
我会绕一个圈,走回到实验室
4楼2013-07-26 15:13:40
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