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令我崩溃的TA克隆，老是连不上
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我用康为世纪2*ES taq酶PCR出来约2000bp的条带，用康为世纪的胶回收试剂盒回收，回收条带电泳显示比最亮的Marker带还亮。与Takara PMD 18-T连接，按说明书推荐的程序连接。也做过12h 16℃的连接。然后进行蓝白斑筛选。500bp阳性对照平板：白斑数量非常多，有少量蓝斑。阴性对照（只加载体）：全是蓝斑。实验组：每次都有蓝斑和白斑，白斑数量10个以内，蓝斑数量比白斑多。将白斑全部挑取做菌落PCR和提质粒，全部是空载。曾经挑白斑测序两次，均显示是空载。 曾经的怀疑与验证： 1、连接体系及感受态的问题 连接时间做过16℃8h、12h，4℃ 12h的，载体与目的片段的比例做过1:3、1:6的。每次实验组均失败，显示空载。而阳性对照却没有问题。换用同学的康为世纪PUC 18载体做，实验组也失败，阳性对照正常。感受态为自己做的DH 5α，阳性对照做的没有问题。 2、PCR产物未加A 直接用PCR产物连接，转化后挑白斑。挑30个白斑，只有一个显示可能为连上，现正在测序。 现在的问题： 1、为什么胶回收后连接，白斑是空载，连上了什么？Takara 技术支持说，连上了小片段。我想小片段从哪儿来的呢？也不至于全连上了小片段吧。 2、是否可能是PCR产物有问题？我想即使p出来的不是我要的目的片段，那也不至于连不上吧？pcr产物会有什么问题呢？ 问了很多的人，他们都说TA克隆很容易啊，怎么会连不上呢？我就是连不上，没人给个为什么？我已经反反复复的做了4个月了。还是不知道是为什么？觉得很生气也有点搞笑。。。。。真的无语了。烦请高手赐教，我不惜送上我所有的金币。 |
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阳性control没有问题，说明vector等试剂没有问题。你的PCR产物可能不纯。 Takara技术支持说的很合逻辑，如果小片段过多就会影响你目标片段的插入。 TA克隆时，最好将PCR 产物跑胶，然后切下目标条带，胶回收，这样可以去除非目标片段的影响； 然后就是末尾加A，一般的聚合酶说明书上都有注明，这个聚合酶产生的PCR 产物能不能直接用于TA连接，如果没有，确保用可以生成多余A的聚合酶处理。 另外，TA克隆的技术已经非常高了，一般假阳性出现的频率非常低，出现的主要问题大多是PCR产物。但我也碰到过一次vector失活的情况，那种情况向，从阳性control就可以看到。 |
3楼2013-08-13 05:56:38
huguangdong
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1 首先确认你这个2*ES taq酶是高保真酶还是普通TAQ聚合酶，如果是高保真酶，PCR扩增产物为平末端，需要加A处理才能进行TA克隆，否则肯定失败，如果是TAQ酶可以直接操作。 2 看你的描述，连接温度应该没有问题，一般我是4度过夜没有连不上的。 3 如果用普通连接酶可能效率有点低，用TAKARA的SOLUTION I效率会更高，但是你的情况应该不是这个原因。 4 其实按照你的描述，我认为你们自己做的感受态的转化效率还是比较低的，一般的阳性对照都是质粒，质粒的转化效率特别高，即使感受态不是很好也能长出不少菌落，而连接产物相对于质粒转化效率要低很多，如果感受态细胞不是很好的话，最后出来的阳性菌落就比较少，所以你之所以不成功，可能和这个有很大关系，建议购买商品化感受态细胞来完成实验。 你的TA克隆实验总体来说，失败的原因不是第1条就是第4条。 |
11楼2013-08-13 12:21:57
Sthunder
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| 楼主你好，我前段时间做蓝白斑也出现了跟你一样的问题，就是有蓝斑有白斑，挑白斑菌p没有条带。我后来是这样做的，把一部分白斑单菌落挑到液体培养基培养6小时左右，做菌落PCR。在挑取一部分白斑单菌落直接加水做菌p。后来直接挑的单菌落有了条带，我又把平板培养了一下，挑了那个有条带的单菌落进液体培养基，再过夜培养，然后提质粒，再p，也有了条带。我的连接产物是胶回收以后的，条带不是很亮，我估计有这方面原因。楼主的问题可能也出在pcr上，但是菌落pcr有时也会出问题。楼上有位虫子说的全式金的试剂我用过，十分好用，不用蓝白斑筛选，直接长出来的就是阳性克隆，如果楼主想换试剂，可以考虑 |
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22楼2013-08-15 17:18:07
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曾经试过用高保真酶扩增产物，不用加A都可以连接T载体，因为酶是同事的说不用额外加A，只是片段测序结果不对所以要重新扩增，结果，怎么转化都没有长菌。 后来还是在PCR产物上加A，就顺利连上，只是片段还是不对而已  所以不管是用据说多好的高保真酶，只要是高保真的，我都自己加A，不想再做白工 ps：4个月都做不出才上木虫来问，有点迟哦~ |
13楼2013-08-13 13:45:07
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