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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 令我崩溃的TA克隆，老是连不上
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scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by changes at 2013-08-14 15:57:28
感觉“用Pfu扩增，PCR结束后直接往PCR管里加1微升Taq，72度加A，电泳，切胶回收目条带”这样做有较高的风险，万一你的Pfu酶过量了，那么加的A会被“校准下来”，导致所有的工作白做。

还是推荐回收产物加A，步步 ...

呵呵，这个方法我已经用了n年，没问题的。经过PCR，Pfu的活性已经消耗得差不多了，而Taq酶是新加进去的，加A的成功率当然高了。
也有公司把Pfu和Taq酶混合用于PCR扩增，也是可以直接做TA克隆的。
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21楼2013-08-14 16:50:55
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你好，我前段时间做蓝白斑也出现了跟你一样的问题，就是有蓝斑有白斑，挑白斑菌p没有条带。我后来是这样做的，把一部分白斑单菌落挑到液体培养基培养6小时左右，做菌落PCR。在挑取一部分白斑单菌落直接加水做菌p。后来直接挑的单菌落有了条带，我又把平板培养了一下，挑了那个有条带的单菌落进液体培养基，再过夜培养，然后提质粒，再p，也有了条带。我的连接产物是胶回收以后的，条带不是很亮，我估计有这方面原因。楼主的问题可能也出在pcr上，但是菌落pcr有时也会出问题。楼上有位虫子说的全式金的试剂我用过，十分好用，不用蓝白斑筛选，直接长出来的就是阳性克隆，如果楼主想换试剂，可以考虑
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

nanhaibing
22楼2013-08-15 17:18:07
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yangjingjing

木虫 (正式写手)
我之前也是，前面所有的条带出现都是正确的，可是16度连接过夜完了转化长出来的菌没一个是对的~~~后来中断了个把月，试着又慢悠悠的做了次，结果一次就成了，所有的都是阳性的，也不知道是什么原因，所有建议你也停一下，过段时间再试看看呗~
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努力打败一切
23楼2013-08-18 00:45:51
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
这个帖的讨论很精彩！祝楼主实验顺顺利利！
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思路决定出路。。。
24楼2013-08-18 11:13:29
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nanhaibing

铜虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
22楼: Originally posted by windycui at 2013-08-15 17:18:07
楼主你好，我前段时间做蓝白斑也出现了跟你一样的问题，就是有蓝斑有白斑，挑白斑菌p没有条带。我后来是这样做的，把一部分白斑单菌落挑到液体培养基培养6小时左右，做菌落PCR。在挑取一部分白斑单菌落直接加水做菌 ...

谢谢  金币没了  送红花一朵
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25楼2013-08-18 20:33:07
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nanhaibing

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
23楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-08-18 00:45:51
我之前也是，前面所有的条带出现都是正确的，可是16度连接过夜完了转化长出来的菌没一个是对的~~~后来中断了个把月，试着又慢悠悠的做了次，结果一次就成了，所有的都是阳性的，也不知道是什么原因，所有建议你也停 ...

这也挺有意思
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26楼2013-08-18 20:33:53
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nanhaibing

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
24楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-08-18 11:13:29
这个帖的讨论很精彩！祝楼主实验顺顺利利！

谢谢
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27楼2013-08-18 20:34:05
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ljj0720

银虫 (正式写手)
送红花一朵
楼主 你的问题解决了吗  我遇到的问题和你一样 真是快急死人了
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28楼2013-09-02 08:37:56
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
我看错了什么吗？

TA克隆，你不加A怎么能连接呢？
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
29楼2013-09-03 05:31:17
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锦青

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by scienzyme at 2013-08-14 16:50:55
呵呵，这个方法我已经用了n年，没问题的。经过PCR，Pfu的活性已经消耗得差不多了，而Taq酶是新加进去的，加A的成功率当然高了。
也有公司把Pfu和Taq酶混合用于PCR扩增，也是可以直接做TA克隆的。...

我用的是Advantag®2高保真的酶，为什么我P出来的片段连不上T载体？？？我查过这个酶是可以进行TA克隆的
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happy everyday
30楼2013-12-13 20:21:33
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