【答案】应助回帖

11楼2013-08-13 12:21:57

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wahogui

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【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-13 17:13:34

我觉的楼主可以试一下我的办法，我觉的楼主在技术及理论上都没用什么问题，而问题就是出在试剂上面，很多时候我们都回去找自己的问题，但是你知道的在中国分子生物学试剂假货很多，我觉的是你的琼脂糖有问题，你可以换一批试一下。如果不是你可以找一你试验中使用的试剂有哪些可能有问题。

12楼2013-08-13 12:37:13

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sxxuan

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【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-08-13 17:13:44
nanhaibing: 金币+5, ★有帮助, 同病相怜 2013-08-14 09:05:25

曾经试过用高保真酶扩增产物，不用加A都可以连接T载体，因为酶是同事的说不用额外加A，只是片段测序结果不对所以要重新扩增，结果，怎么转化都没有长菌。
后来还是在PCR产物上加A，就顺利连上，只是片段还是不对而已

所以不管是用据说多好的高保真酶，只要是高保真的，我都自己加A，不想再做白工
ps：4个月都做不出才上木虫来问，有点迟哦~

你的日子如何，你的力量也必如何！

13楼2013-08-13 13:45:07

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nanhaibing

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10楼: Originally posted by changes at 2013-08-13 12:12:51
因为你的目的片段约2000bp，载体大小月2700bp。T/A克隆的效率应该不是很高，另外你提到回收的条带非常亮比marker的浓度都高，要注意减少片段的量了，可能1:6的比例不是很合适，目的片段浓度高了，影响连接的效率。
...

我已cDNA为模板扩增的，单克隆验证时是通过蓝白斑筛选后，挑白斑进行菌落PCR，然后提质粒跑电泳，与阳性对照及载体自连的电泳比较。还将白斑测过几次序。

14楼2013-08-14 08:57:33

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nanhaibing

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11楼: Originally posted by huguangdong at 2013-08-13 12:21:57
1 首先确认你这个2*ES taq酶是高保真酶还是普通TAQ聚合酶，如果是高保真酶，PCR扩增产物为平末端，需要加A处理才能进行TA克隆，否则肯定失败，如果是TAQ酶可以直接操作。
2 看你的描述，连接温度应该没有问题，一般 ...

谢谢啊我再把这两个问题排除下。。。

15楼2013-08-14 09:03:28

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nanhaibing

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12楼: Originally posted by wahogui at 2013-08-13 12:37:13
我觉的楼主可以试一下我的办法，我觉的楼主在技术及理论上都没用什么问题，而问题就是出在试剂上面，很多时候我们都回去找自己的问题，但是你知道的在中国分子生物学试剂假货很多，我觉的是你的琼脂糖有问题，你可以 ...

恩谢谢我再尝试下

16楼2013-08-14 09:04:40

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nanhaibing

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13楼: Originally posted by sxxuan at 2013-08-13 13:45:07
曾经试过用高保真酶扩增产物，不用加A都可以连接T载体，因为酶是同事的说不用额外加A，只是片段测序结果不对所以要重新扩增，结果，怎么转化都没有长菌。
后来还是在PCR产物上加A，就顺利连上，只是片段还是不对而 ...

谢谢中间不停地排除各种因素，气死我了，最终也没找到。。。

17楼2013-08-14 09:06:09

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scienzyme

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我用过全式金的pEASY载体，自己用Pfu扩增，PCR结束后直接往PCR管里加1微升Taq，72度加A，电泳，切胶回收目条带，1微升的pEASY载体加4微升的目的条带，25度连接10-15分钟，转化全式金提供的大肠杆菌感受态细胞。挑的菌落不用蓝白筛选，全部都是阳性克隆。

18楼2013-08-14 09:37:54

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changes

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引用回帖:

14楼: Originally posted by nanhaibing at 2013-08-14 08:57:33
我已cDNA为模板扩增的，单克隆验证时是通过蓝白斑筛选后，挑白斑进行菌落PCR，然后提质粒跑电泳，与阳性对照及载体自连的电泳比较。还将白斑测过几次序。...

哦，我们一般是提取质粒进行酶切，只有酶切后验证确实有目的条带切出来的才送测序。当然成本高了些，时间也多了些。但是这样能保证测序结果有而不是空载体。

另外，PCR有时候不怎么可靠，而且电泳条带较多时也是难以判断到底哪条带才是你感兴趣的。

19楼2013-08-14 15:53:26

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changes

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引用回帖:

18楼: Originally posted by scienzyme at 2013-08-14 09:37:54
我用过全式金的pEASY载体，自己用Pfu扩增，PCR结束后直接往PCR管里加1微升Taq，72度加A，电泳，切胶回收目条带，1微升的pEASY载体加4微升的目的条带，25度连接10-15分钟，转化全式金提供的大肠杆菌感受态细胞。挑的 ...

感觉“用Pfu扩增，PCR结束后直接往PCR管里加1微升Taq，72度加A，电泳，切胶回收目条带”这样做有较高的风险，万一你的Pfu酶过量了，那么加的A会被“校准下来”，导致所有的工作白做。

还是推荐回收产物加A，步步为营更可靠些。