24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 6948  |  回复: 33

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流经验 2013-08-13 17:13:24
nanhaibing: 金币+5, 有帮助, 1和4的原因,可能比较对 2013-08-14 09:02:59
gyesang: 回帖置顶 2013-08-14 17:39:18
1 首先确认你这个2*ES taq酶是高保真酶还是普通TAQ聚合酶,如果是高保真酶,PCR扩增产物为平末端,需要加A处理才能进行TA克隆,否则肯定失败,如果是TAQ酶可以直接操作。
2 看你的描述,连接温度应该没有问题,一般我是4度过夜没有连不上的。
3 如果用普通连接酶可能效率有点低,用TAKARA的SOLUTION I效率会更高,但是你的情况应该不是这个原因。
4 其实按照你的描述,我认为你们自己做的感受态的转化效率还是比较低的,一般的阳性对照都是质粒,质粒的转化效率特别高,即使感受态不是很好也能长出不少菌落,而连接产物相对于质粒转化效率要低很多,如果感受态细胞不是很好的话,最后出来的阳性菌落就比较少,所以你之所以不成功,可能和这个有很大关系,建议购买商品化感受态细胞来完成实验。
你的TA克隆实验总体来说,失败的原因不是第1条就是第4条。
11楼2013-08-13 12:21:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wahogui

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-13 17:13:34
我觉的楼主可以试一下我的办法,我觉的楼主在技术及理论上都没用什么问题,而问题就是出在试剂上面,很多时候我们都回去找自己的问题,但是你知道的在中国分子生物学试剂假货很多,我觉的是你的琼脂糖有问题,你可以换一批试一下。如果不是你可以找一你试验中使用的试剂有哪些可能有问题。
12楼2013-08-13 12:37:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-08-13 17:13:44
nanhaibing: 金币+5, 有帮助, 同病相怜 2013-08-14 09:05:25
曾经试过用高保真酶扩增产物,不用加A都可以连接T载体,因为酶是同事的说不用额外加A,只是片段测序结果不对所以要重新扩增,结果,怎么转化都没有长菌。
后来还是在PCR产物上加A,就顺利连上,只是片段还是不对而已
所以不管是用据说多好的高保真酶,只要是高保真的,我都自己加A,不想再做白工
ps:4个月都做不出才上木虫来问,有点迟哦~
你的日子如何,你的力量也必如何!
13楼2013-08-13 13:45:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nanhaibing

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by changes at 2013-08-13 12:12:51
因为你的目的片段约2000bp,载体大小月2700bp。T/A克隆的效率应该不是很高,另外你提到回收的条带非常亮比marker的浓度都高,要注意减少片段的量了,可能1:6的比例不是很合适,目的片段浓度高了,影响连接的效率。
...

我已cDNA为模板扩增的,单克隆验证时是通过蓝白斑筛选后,挑白斑进行菌落PCR,然后提质粒跑电泳,与阳性对照及载体自连的电泳比较。还将白斑测过几次序。
14楼2013-08-14 08:57:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nanhaibing

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
11楼: Originally posted by huguangdong at 2013-08-13 12:21:57
1 首先确认你这个2*ES taq酶是高保真酶还是普通TAQ聚合酶,如果是高保真酶,PCR扩增产物为平末端,需要加A处理才能进行TA克隆,否则肯定失败,如果是TAQ酶可以直接操作。
2 看你的描述,连接温度应该没有问题,一般 ...

谢谢啊  我再把这两个问题排除下 。。。
15楼2013-08-14 09:03:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nanhaibing

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by wahogui at 2013-08-13 12:37:13
我觉的楼主可以试一下我的办法,我觉的楼主在技术及理论上都没用什么问题,而问题就是出在试剂上面,很多时候我们都回去找自己的问题,但是你知道的在中国分子生物学试剂假货很多,我觉的是你的琼脂糖有问题,你可以 ...

恩   谢谢  我再尝试下
16楼2013-08-14 09:04:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nanhaibing

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by sxxuan at 2013-08-13 13:45:07
曾经试过用高保真酶扩增产物,不用加A都可以连接T载体,因为酶是同事的说不用额外加A,只是片段测序结果不对所以要重新扩增,结果,怎么转化都没有长菌。
后来还是在PCR产物上加A,就顺利连上,只是片段还是不对而 ...

谢谢    中间不停地排除各种因素,气死我了,最终也没找到。。。
17楼2013-08-14 09:06:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-08-14 17:30:43
我用过全式金的pEASY载体,自己用Pfu扩增,PCR结束后直接往PCR管里加1微升Taq,72度加A,电泳,切胶回收目条带,1微升的pEASY载体加4微升的目的条带,25度连接10-15分钟,转化全式金提供的大肠杆菌感受态细胞。挑的菌落不用蓝白筛选,全部都是阳性克隆。
18楼2013-08-14 09:37:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

changes

木虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-08-14 17:40:48
引用回帖:
14楼: Originally posted by nanhaibing at 2013-08-14 08:57:33
我已cDNA为模板扩增的,单克隆验证时是通过蓝白斑筛选后,挑白斑进行菌落PCR,然后提质粒跑电泳,与阳性对照及载体自连的电泳比较。还将白斑测过几次序。...

哦,我们一般是提取质粒进行酶切,只有酶切后验证确实有目的条带切出来的才送测序。当然成本高了些,时间也多了些。但是这样能保证测序结果有而不是空载体。

另外,PCR有时候不怎么可靠,而且电泳条带较多时也是难以判断到底哪条带才是你感兴趣的。
19楼2013-08-14 15:53:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

changes

木虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-14 17:41:16
引用回帖:
18楼: Originally posted by scienzyme at 2013-08-14 09:37:54
我用过全式金的pEASY载体,自己用Pfu扩增,PCR结束后直接往PCR管里加1微升Taq,72度加A,电泳,切胶回收目条带,1微升的pEASY载体加4微升的目的条带,25度连接10-15分钟,转化全式金提供的大肠杆菌感受态细胞。挑的 ...

感觉“用Pfu扩增,PCR结束后直接往PCR管里加1微升Taq,72度加A,电泳,切胶回收目条带”这样做有较高的风险,万一你的Pfu酶过量了,那么加的A会被“校准下来”,导致所有的工作白做。

还是推荐回收产物加A,步步为营更可靠些。
20楼2013-08-14 15:57:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 nanhaibing 的主题更新
信息提示
请填处理意见