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艾草104铜虫 (初入文坛)
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PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解? 已有3人参与
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| 我在做载体构建，基因大小为1722bp,用的是EcoRI和XbaI两个酶切位点，保护碱基都是加的GAGAGA，随便加的。PCR出来了，片段大小看起来都没有什么问题。基因片段做EcoRI和XbaI的双酶切，从大小上看，应该都是切开了。然后做连接。连接用的是TAKARA的连接液，批号6022的那种，里面有SolutionI、SolutionII和SolutionIII。SolutionI是Enzyme Solution，Solution II是Concatenation Buffer, Solution III是Transformation Enhancer。转化的时候加SolutionIII就会长出菌落，但都是假阳性的，还特别多。不加SolutionII就长不出菌落来！各位，给我分析一下，到底是哪里出了问题。 |
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luwei13566
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3楼2014-06-03 14:45:02
caitlin0626
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-03 18:44:58
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同样的问题，可以参考这个帖子，希望对你有所帮助：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6358938&authorid=1430329 目标片段扩增出来以后，先进行纯化，本人不太主张用胶回收方法纯化。如果条带特异，直接用试剂盒回收。如果条带不特异，把pcr产物作为模板再重复做一次扩增，得到较纯的条带后再回收。后者同时进行较回收，做平行试验。 回收后的片段俺比例与T载体混合，先做TA克隆，具体的加A什么的不详谈了。 连接产物转化后挑克隆，PCR检测，阳性菌液提取质粒酶切检测，然后送公司测序。 测序正确的阳性克隆再酶切后与目标载体进行载体构建，推荐利用酒精沉淀回收连接相结合的方法 祝楼主顺利！ |
4楼2014-06-03 16:06:31
艾草104
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5楼2014-06-03 19:01:59
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