应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解?
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
152/2返回列表上一页12
查看: 3808  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

qiaofen

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 艾草104 at 2014-06-03 19:01:59
还是有疑问，如果说是保护碱基的问题，我师兄之前就是用的GAGAGA，一样的这两个酶切位点，两个基因都做出来了的，怎么解释啊！没有切开，是不是可以延长酶切时间...

酶切前要纯化，双酶切使用什么buffer很重要，在公司网站上可以查到具体用什么buffer
赞一下 回复此楼
天天向上！
11楼2014-06-11 13:16:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-11 18:56:39
引用回帖:
9楼: Originally posted by 艾草104 at 2014-06-11 13:06:32
第一张图是做的连接产物的核酸电泳，顺序是连接产物、重组质粒对照（与链接产物理论上大小很接近）、DNAmarker。第二张图顺序是PCR片段双酶切、PCR片段、载体双酶切、载体对照、DNAmarker。链接比例载体：基因片段 ...

1.你的连接液是做了浓缩跑出来的条带吗？这么亮。不需要这么高浓度的。说明书上也就有5-10ul的体系，0.03pmol：0.03—0.3pmol的载体基因比就可以了。根据你基因和载体大小，总质量比大约65ng：32—320ng之间。一般做连接比例1:3——1:10都是按照摩尔数来算的，也就是你的载体加65ng，你的基因加96ng—320ng，根据你载体和基因的浓度来确定加多少体积。如果你的浓度比较低也不需要做浓缩，浓度只要不太低至少也能连出来东西，只不过转化子不会多。
2.你跑的PCR双酶切没什么作用，因为切开没有肉眼看不出来。你的引物保护碱基加了几个？如果只有2—3个建议再多加3个。
3.EcoRI和XbaI体系：基因和载体添加1ug   双酶切基因37度 3——4个小时。载体37度3个小时。切完直接纯化不割胶。如果担心star活性直接用兼容buffer的快切酶切1h足够了。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
12楼2014-06-11 14:58:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

艾草104

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 14:58:24
1.你的连接液是做了浓缩跑出来的条带吗？这么亮。不需要这么高浓度的。说明书上也就有5-10ul的体系，0.03pmol：0.03—0.3pmol的载体基因比就可以了。根据你基因和载体大小，总质量比大约65ng：32—320ng之间。一般 ...

连接液是直接取来电泳的，也不太明白为什么这么亮，用Nanodrop测的载体和基因片段浓度都大约只有25ng/ul。2.5uL载体，7.5uL基因片段，10uL 连接液（含连接酶和缓冲液），4度连接过夜后直接取了5uL电泳，跑出来就这么亮了。引物的保护碱基加了6个，不少了。酶切的时候都是1ug的量来切的。
赞一下 回复此楼
生活本是折磨，看透了，看懂了，接受了，才能叫享受
13楼2014-06-11 16:00:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 艾草104 at 2014-06-11 16:00:12
连接液是直接取来电泳的，也不太明白为什么这么亮，用Nanodrop测的载体和基因片段浓度都大约只有25ng/ul。2.5uL载体，7.5uL基因片段，10uL 连接液（含连接酶和缓冲液），4度连接过夜后直接取了5uL电泳，跑出来就这 ...

还有酶切后酶连你试一下16度过夜连接。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
14楼2014-06-11 16:41:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

艾草104

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 16:41:59
还有酶切后酶连你试一下16度过夜连接。...

都是试过的
回复此楼
生活本是折磨，看透了，看懂了，接受了，才能叫享受
15楼2014-06-11 20:36:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 艾草104 的主题更新
152/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料调剂 +7 吴棂颖！ 2026-04-03 7/350 2026-04-03 19:47 by 百灵童888
[考研] 310求调剂 +18 争取九点睡 2026-03-30 18/900 2026-04-03 18:35 by ls刘帅
[考研] 303求调剂 +9 DLkz1314. 2026-03-30 9/450 2026-04-03 18:34 by ls刘帅
[考研] 一志愿北京科技大学材料工程085601，求调剂 +13 cdyw 2026-04-02 14/700 2026-04-03 18:23 by ls刘帅
[考研] 315求调剂 +12 小羊小羊_ 2026-04-02 12/600 2026-04-03 18:22 by ls刘帅
[考研] 材料专硕调剂 +18 椰椰。 2026-03-29 18/900 2026-04-03 16:45 by 玲玲0606
[考研] 321求调剂 +17 y-yh 2026-04-01 20/1000 2026-04-03 12:57 by y-yh
[考研] 275求调剂 +14 waltzh 2026-04-01 14/700 2026-04-03 11:24 by qqq850810
[考研] 一志愿中国科学院大学265求调剂 +9 恬淡ye 2026-03-31 10/500 2026-04-03 11:10 by txp1986
[考研] 一志愿武汉理工0856，初试334 +3 26考研材料 2026-04-02 3/150 2026-04-02 21:22 by dongzh2009
[考研] 318求调剂，计算材料方向 +10 吸喵有害笙命 2026-04-01 11/550 2026-04-02 16:29 by oooqiao
[考研] 282求调剂 +13 呼吸都是减肥 2026-04-01 13/650 2026-04-02 14:10 by baoball
[考研] 找调剂 +6 楚乔乔 2026-04-01 6/300 2026-04-02 12:06 by xiaoranmu
[考研] 0856初试324分求调剂 +6 想上学求调 2026-04-01 6/300 2026-04-02 11:42 by 星空星月
[考研] 284求调剂 +12 小熊～～ 2026-03-31 12/600 2026-04-01 20:23 by 花??
[考研] 调剂 +3 好好读书。 2026-04-01 3/150 2026-04-01 17:06 by zhouyuwinner
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +7 hanamiko 2026-03-30 7/350 2026-04-01 13:22 by JourneyLucky
[考研] 352分-085602-一志愿985 +6 海纳百川Ly 2026-03-29 6/300 2026-03-31 21:06 by yuq
[考研] 080200学硕，机械工程专业277分，求带走！ +4 瓶子PZ 2026-03-31 4/200 2026-03-31 20:16 by vgtyfty
[考研] 08工科求调剂286 +5 tgs_001 2026-03-28 5/250 2026-03-31 08:18 by 一只好果子?
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭