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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解?
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qiaofen

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 艾草104 at 2014-06-03 19:01:59
还是有疑问，如果说是保护碱基的问题，我师兄之前就是用的GAGAGA，一样的这两个酶切位点，两个基因都做出来了的，怎么解释啊！没有切开，是不是可以延长酶切时间...

酶切前要纯化，双酶切使用什么buffer很重要，在公司网站上可以查到具体用什么buffer
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天天向上！
11楼2014-06-11 13:16:14
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-11 18:56:39
引用回帖:
9楼: Originally posted by 艾草104 at 2014-06-11 13:06:32
第一张图是做的连接产物的核酸电泳，顺序是连接产物、重组质粒对照（与链接产物理论上大小很接近）、DNAmarker。第二张图顺序是PCR片段双酶切、PCR片段、载体双酶切、载体对照、DNAmarker。链接比例载体：基因片段 ...

1.你的连接液是做了浓缩跑出来的条带吗？这么亮。不需要这么高浓度的。说明书上也就有5-10ul的体系，0.03pmol：0.03—0.3pmol的载体基因比就可以了。根据你基因和载体大小，总质量比大约65ng：32—320ng之间。一般做连接比例1:3——1:10都是按照摩尔数来算的，也就是你的载体加65ng，你的基因加96ng—320ng，根据你载体和基因的浓度来确定加多少体积。如果你的浓度比较低也不需要做浓缩，浓度只要不太低至少也能连出来东西，只不过转化子不会多。
2.你跑的PCR双酶切没什么作用，因为切开没有肉眼看不出来。你的引物保护碱基加了几个？如果只有2—3个建议再多加3个。
3.EcoRI和XbaI体系：基因和载体添加1ug   双酶切基因37度 3——4个小时。载体37度3个小时。切完直接纯化不割胶。如果担心star活性直接用兼容buffer的快切酶切1h足够了。
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大家相互帮助哈
12楼2014-06-11 14:58:24
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艾草104

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 14:58:24
1.你的连接液是做了浓缩跑出来的条带吗？这么亮。不需要这么高浓度的。说明书上也就有5-10ul的体系，0.03pmol：0.03—0.3pmol的载体基因比就可以了。根据你基因和载体大小，总质量比大约65ng：32—320ng之间。一般 ...

连接液是直接取来电泳的，也不太明白为什么这么亮，用Nanodrop测的载体和基因片段浓度都大约只有25ng/ul。2.5uL载体，7.5uL基因片段，10uL 连接液（含连接酶和缓冲液），4度连接过夜后直接取了5uL电泳，跑出来就这么亮了。引物的保护碱基加了6个，不少了。酶切的时候都是1ug的量来切的。
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生活本是折磨，看透了，看懂了，接受了，才能叫享受
13楼2014-06-11 16:00:12
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 艾草104 at 2014-06-11 16:00:12
连接液是直接取来电泳的，也不太明白为什么这么亮，用Nanodrop测的载体和基因片段浓度都大约只有25ng/ul。2.5uL载体，7.5uL基因片段，10uL 连接液（含连接酶和缓冲液），4度连接过夜后直接取了5uL电泳，跑出来就这 ...

还有酶切后酶连你试一下16度过夜连接。
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大家相互帮助哈
14楼2014-06-11 16:41:59
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艾草104

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 16:41:59
还有酶切后酶连你试一下16度过夜连接。...

都是试过的
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生活本是折磨，看透了，看懂了，接受了，才能叫享受
15楼2014-06-11 20:36:34
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