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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解?
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艾草104

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解? 已有3人参与

我在做载体构建，基因大小为1722bp,用的是EcoRI和XbaI两个酶切位点，保护碱基都是加的GAGAGA，随便加的。PCR出来了，片段大小看起来都没有什么问题。基因片段做EcoRI和XbaI的双酶切，从大小上看，应该都是切开了。然后做连接。连接用的是TAKARA的连接液，批号6022的那种，里面有SolutionI、SolutionII和SolutionIII。SolutionI是Enzyme Solution，Solution II是Concatenation Buffer, Solution III是Transformation Enhancer。转化的时候加SolutionIII就会长出菌落，但都是假阳性的，还特别多。不加SolutionII就长不出菌落来！各位，给我分析一下，到底是哪里出了问题。
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生活本是折磨，看透了，看懂了，接受了，才能叫享受
1楼 2014-06-03 14:15:02
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艾草104

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-09 20:23:06
LZ你能给我说说你的酶切图从左到右依次是什么吗？哪一个是你连接产物的双酶切检测？你载体和基因的连接比例和连接条件都是多少？？感受态细胞做过阳性对照没？其次建议下次酶切37度2h—3h。我至少用这两个酶切割2— ...

第一张图是做的连接产物的核酸电泳，顺序是连接产物、重组质粒对照（与链接产物理论上大小很接近）、DNAmarker。第二张图顺序是PCR片段双酶切、PCR片段、载体双酶切、载体对照、DNAmarker。链接比例载体：基因片段~1：3.感受态做过阳性对照，是没有问题的。酶切时间是有点短，切了1个多点、小时。
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生活本是折磨，看透了，看懂了，接受了，才能叫享受
9楼2014-06-11 13:06:32
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caitlin0626

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-11 18:56:23
酶切连接操作应该都是用的标准化试剂吧，各种buffer酶啊什么的按量加就好了。另外，载体片段是不是带抗性的？别整出来一堆杂菌。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-06-03 14:30:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
艾草104: 金币+5, ★★★很有帮助, 我也正在考虑是不是保护碱基的问题，拿不定，谢谢！ 2014-06-03 16:22:53
1.你怎么通过肉眼判断你的基因就一定完全双酶切了呢？
2.假阳性多应该是你的基因和你的载体都没有完全双酶切，你把你双酶切处理的质粒不加基因做对照转化应该就有很多转化子。
3.XbaI的保护碱基与酶切位点相连的部分为   GC  TCTAGA   再往外的保护碱基随便加。 EcoRI也是如此。
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大家相互帮助哈
3楼2014-06-03 14:45:02
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-03 18:44:58
同样的问题，可以参考这个帖子，希望对你有所帮助：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6358938&authorid=1430329
目标片段扩增出来以后，先进行纯化，本人不太主张用胶回收方法纯化。如果条带特异，直接用试剂盒回收。如果条带不特异，把pcr产物作为模板再重复做一次扩增，得到较纯的条带后再回收。后者同时进行较回收，做平行试验。
回收后的片段俺比例与T载体混合，先做TA克隆，具体的加A什么的不详谈了。
连接产物转化后挑克隆，PCR检测，阳性菌液提取质粒酶切检测，然后送公司测序。
测序正确的阳性克隆再酶切后与目标载体进行载体构建，推荐利用酒精沉淀回收连接相结合的方法
祝楼主顺利！
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
4楼2014-06-03 16:06:31
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