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阳光金鱼唐

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[交流] 【求助/交流】假阳性是什么原因造成的？已有7人参与

蓝白斑筛选，长出了蓝斑和白斑，我挑白斑扩大培养，然后以菌液为模板，用目的片段的引物做PCR，却得不到我要的目的片段，是目的片段与载体没连接上吗？还是没转化成功？是假阳性吗？因为检测不出来，我目前也没法送去测序，急！！！还有，我后来重复做了多次，都长不出任何东西了，是不是载体放过期了，还是T4连接酶失效了？试剂盒从买回来到现在超过半年了，第一次动用是在4个月前，中间又用过几次。哪位大虾能够答疑，在下将感激涕零！

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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了

1楼 2010-04-29 13:29:13

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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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lstt09nk(金币+1): 2010-04-29 15:29

应该是没有连上吧，假阳性原因很多：可能是X-gal 和IPTG没有涂开，也有可能染菌等
载体放-20°放个一年应该没有问题，至于连接酶失效有这种可能，你可以换一下吧
T载体连接是挺容易的再做一次吧

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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋

2楼2010-04-29 14:00:08

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yujiaping1

木虫 (著名写手)

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lstt09nk(金币+2):热心虫友~~ 2010-04-29 15:29

第一个问题，你挑的白斑是含有插入片段载体的菌，这是毋庸置疑的，因为如果载体自连，那么就是蓝斑，如果没有载体，菌就没有抗性，无法生长，所以一定是含有插入片段载体的菌，但是这个插入片段不一定是目的片段，造成这种现象的原因很多，PCR产物不纯，连接上引物片段，或者存在质粒污染等，针对这种现象，一般就是多挑白斑，筛选到阳性克隆。

第二个问题，我认为你的载体半年肯定不会有问题，而且之前你成功的获得了阳性克隆，现在建议你做一下试剂盒提供的对照，如果没有问题，就说明的目的片段的浓度和载体的配比或者是目的片段太长，连接失败造成的。
但就目前的情况看，你连蓝斑都看不见了，估计你做对照也不一定能行，所以很有可能是你的培养基或者抗性之类的出问题了，好好检查一下

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3楼2010-04-29 15:02:53

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