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鸡肝中氯霉素检测为何出现假阳性？（ELISA检测） 已有3人参与
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本人从事食品残留监测工作，从业时间半年。最近做鸡肝中氯霉素检测项目遇到些无法解释的问题，现把我个人总结与分析同大家分享，跪求专业人士参与讨论，指点迷津。 我所用的方法是间接竞争ELISA（望尔公司氯霉素检测试剂盒）共进行41批样品的检测（这些样品来自于不同地市）。检测结果前21阴性（1-21号，后20批阳性（21-41号），按照以往的经验分析绝对不可能出现如此多的阳性，于是对20批阳性复检，均为阴性。 分析原因：因为检测试剂盒为新购置，在保质期内，而且阴性/阳性结果分布规律，同一排ELISA孔出现两种不同结果（同一列，前3排孔为阴性，后5排孔为阳性），因此我排除了试剂盒质量问题，也排除ELISA检测过程操作问题，我认为问题应该出现在样品前处理步骤。 鸡肝中氯霉素样品前处理步骤较为简单，称3g鸡肝匀浆，6mL乙酸乙酯提取，振荡10m，离心10m，取4ml上清，氮气吹干，1ml正己烷悬起，加1ml复溶工作液（公司提供）涡旋振荡30s，离心15m，弃上层，下层备用。如此简单的步骤竟然出现问题，实在汗颜。我分析原因，按照我的理解将各步骤逐一分析，此处需请各位专家指证。 1、 现将称取振荡离心吹干等步骤省略（安全按照说明说时间操作），因这些步骤不会对检测结果产生直接影响。 2、 6ml乙酸乙酯。我排除此步骤原因有三：首先我操作时使用的色谱纯，纯度高于分析纯，纯度高于实验所需，且该瓶溶液已经用于其他实验操作结果正确，排除乙酸乙酯质量问题。二，回忆当初操作步骤，因乙酸乙酯有特殊的香味，应当不会加错。三，退一步说即使当时我加的不是乙酸乙酯，因不会出现阳性结果而应该是阴性。因此我分析问题不出现在此步骤。 3、 正己烷悬起。我个人理解，正己烷的作用是除去鸡肝中脂肪，防止脂肪对检测结果产生影响。当时为保险起见我将添加量加倍，用2ml悬起涡旋。如果此步骤出现问题，鸡肝中脂肪未除去，确实会产生假阳性的可能。 4、 加复溶工作液1ml。我请教过同事，说复溶液是缓冲液，作用是调节ph，我不知道公司所带的复溶液成分，我想应该是以水为主的液体，或许兼有调节ph作用，因试剂盒要求，复溶液同时也用作稀释抗体工作液用。公司所给复溶液需2倍稀释，按我的印象此步骤没有问题。但还是对此做了分析，排除原因有以下几点：一、有人质疑我误将洗涤液当复溶液加入，我想洗涤液作用应该是封闭EILSA中为结合的抗原抗体位点，如果加入的洗涤液，其ELISA反应将不会进行，也不会出现假阳性的结果，应该是阴性结果吧。二、公司所提供40ml洗液，我配置了400ml洗液，按照20*稀释比例我用了20ml浓缩洗液，我量取了剩余洗液仍为20ml，因此不会出现误用洗液当复溶液的错误。 基于以上四点我将错误焦点锁在正己烷上。有的同事说我正己烷加错了，但我个人认为我没有加错，因为当时通风橱操作区内只有一瓶500ml棕色瓶，我当时按每个样品2ml加入，加入正己烷悬起后正己烷呈黄色，离心后在液体上层，我吸出后留取下层溶液备用，且吸取时味道确为正己烷。下层备用溶液为无色透明。各种迹象表明我没用加错，确实为正己烷。为了验证此溶液是否失效，我在重新处理时仍有数个样品使用该瓶正己烷，结果正常。因此可排除正己烷失效或拿错的可能。不知道我的分析是否正确，既然我排除了所有的可能，但20批样品的假阳性确实出现，我实在分析不出原因，所以发此贴请各位专家指点。 另外还有个可能，我使用的烧杯或大枪头被氯霉素污染。因为在我做实验之前其他同事做过农业部比对项目，其中有氯霉素检测项目。但无法确定，此原因暂不讨论。是否还有其他我未想到的原因或我理解错误的情况，也请指点。 |
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