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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 实验室分析、仪器 » 鸡肝中氯霉素检测为何出现假阳性？（ELISA检测）
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lyd0311

银虫 (小有名气)

[交流] 鸡肝中氯霉素检测为何出现假阳性？（ELISA检测） 已有3人参与

本人从事食品残留监测工作，从业时间半年。最近做鸡肝中氯霉素检测项目遇到些无法解释的问题，现把我个人总结与分析同大家分享，跪求专业人士参与讨论，指点迷津。
     我所用的方法是间接竞争ELISA（望尔公司氯霉素检测试剂盒）共进行41批样品的检测（这些样品来自于不同地市）。检测结果前21阴性（1-21号，后20批阳性（21-41号），按照以往的经验分析绝对不可能出现如此多的阳性，于是对20批阳性复检，均为阴性。
分析原因：因为检测试剂盒为新购置，在保质期内，而且阴性/阳性结果分布规律，同一排ELISA孔出现两种不同结果（同一列，前3排孔为阴性，后5排孔为阳性），因此我排除了试剂盒质量问题，也排除ELISA检测过程操作问题，我认为问题应该出现在样品前处理步骤。
鸡肝中氯霉素样品前处理步骤较为简单，称3g鸡肝匀浆，6mL乙酸乙酯提取，振荡10m，离心10m，取4ml上清，氮气吹干，1ml正己烷悬起，加1ml复溶工作液（公司提供）涡旋振荡30s，离心15m，弃上层，下层备用。如此简单的步骤竟然出现问题，实在汗颜。我分析原因，按照我的理解将各步骤逐一分析，此处需请各位专家指证。
1、        现将称取振荡离心吹干等步骤省略（安全按照说明说时间操作），因这些步骤不会对检测结果产生直接影响。
2、        6ml乙酸乙酯。我排除此步骤原因有三：首先我操作时使用的色谱纯，纯度高于分析纯，纯度高于实验所需，且该瓶溶液已经用于其他实验操作结果正确，排除乙酸乙酯质量问题。二，回忆当初操作步骤，因乙酸乙酯有特殊的香味，应当不会加错。三，退一步说即使当时我加的不是乙酸乙酯，因不会出现阳性结果而应该是阴性。因此我分析问题不出现在此步骤。
3、        正己烷悬起。我个人理解，正己烷的作用是除去鸡肝中脂肪，防止脂肪对检测结果产生影响。当时为保险起见我将添加量加倍，用2ml悬起涡旋。如果此步骤出现问题，鸡肝中脂肪未除去，确实会产生假阳性的可能。
4、        加复溶工作液1ml。我请教过同事，说复溶液是缓冲液，作用是调节ph，我不知道公司所带的复溶液成分，我想应该是以水为主的液体，或许兼有调节ph作用，因试剂盒要求，复溶液同时也用作稀释抗体工作液用。公司所给复溶液需2倍稀释，按我的印象此步骤没有问题。但还是对此做了分析，排除原因有以下几点：一、有人质疑我误将洗涤液当复溶液加入，我想洗涤液作用应该是封闭EILSA中为结合的抗原抗体位点，如果加入的洗涤液，其ELISA反应将不会进行，也不会出现假阳性的结果，应该是阴性结果吧。二、公司所提供40ml洗液，我配置了400ml洗液，按照20*稀释比例我用了20ml浓缩洗液，我量取了剩余洗液仍为20ml，因此不会出现误用洗液当复溶液的错误。
基于以上四点我将错误焦点锁在正己烷上。有的同事说我正己烷加错了，但我个人认为我没有加错，因为当时通风橱操作区内只有一瓶500ml棕色瓶，我当时按每个样品2ml加入，加入正己烷悬起后正己烷呈黄色，离心后在液体上层，我吸出后留取下层溶液备用，且吸取时味道确为正己烷。下层备用溶液为无色透明。各种迹象表明我没用加错，确实为正己烷。为了验证此溶液是否失效，我在重新处理时仍有数个样品使用该瓶正己烷，结果正常。因此可排除正己烷失效或拿错的可能。不知道我的分析是否正确，既然我排除了所有的可能，但20批样品的假阳性确实出现，我实在分析不出原因，所以发此贴请各位专家指点。
另外还有个可能，我使用的烧杯或大枪头被氯霉素污染。因为在我做实验之前其他同事做过农业部比对项目，其中有氯霉素检测项目。但无法确定，此原因暂不讨论。是否还有其他我未想到的原因或我理解错误的情况，也请指点。
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1楼 2011-06-30 21:58:54
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土拨鼠回来了

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
树树8013(金币+2): 谢谢专家交流解答。 2011-07-04 14:59:09
我用ELISA检测黄曲霉B1的时候，遇到过类似的情况，四排孔，每排12个，前两排都没有问题，第三排前6个阴性，后6个和第四排都是阳性，复查之后全部发现都是假阳性，不过我的情况比较简单，试剂盒配有两瓶抗原，出现假阳性加的抗原都是同一瓶，所以当时出问题的是抗原。
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3楼2011-07-02 23:47:13
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lyd0311

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 土拨鼠回来了 at 2011-07-02 23:47:13:
我用ELISA检测黄曲霉B1的时候，遇到过类似的情况，四排孔，每排12个，前两排都没有问题，第三排前6个阴性，后6个和第四排都是阳性，复查之后全部发现都是假阳性，不过我的情况比较简单，试剂盒配有两瓶抗原，出现 ...

我重新做完的结果全都正确 东西还是原来的东西 所以找不到原因了
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4楼2011-07-03 16:03:00
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lorrian

木虫 (小有名气)
★ ★
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树树8013(金币+1): 谢谢参与交流，欢迎常来自己的板块回帖发帖。 2011-07-04 14:59:34
一次的假阳性不能说明问题，所以需要复检，尤其是ELISA方法，本身就有很多影响因素。
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5楼2011-07-03 18:19:00
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Mickey锌粒

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
问一下，你的氯霉素假阳性原因找到没有？我也从事检测工作，最近也遇到像你一样的情况，现在都不知道该怎么办了？
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勇往直前！
6楼2016-02-25 15:27:04
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