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1楼2014-04-08 17:04:31

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meng_xu

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首先你描述的体系就不对，如果你这样做，你的计算存在基本错误。

另外，我感觉你模板加的有点多，我之前做一般都是1ul的o/nculture，如果时间来得及，一般我会用水洗一遍菌，去除LB和代谢的产物。

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20楼2014-05-06 04:45:31

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ltfe567

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-08 17:26:18

最左侧的事DNA Marker 的条带吧？你这好像是出现非特异性条带了，是不是引物没选对呢？或者考虑下降落PCR，我也是新手，咱们互相交流

2楼2014-04-08 17:06:48

sxy900803

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2楼: Originally posted by ltfe567 at 2014-04-08 17:06:48
最左侧的事DNA Marker 的条带吧？你这好像是出现非特异性条带了，是不是引物没选对呢？或者考虑下降落PCR，我也是新手，咱们互相交流

最左边的是Maker,之前师姐都是用的这对引物都是可以的，也不知道问题出在哪，都做了好久的实验了，啥结果都还没，急死人了

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3楼2014-04-08 18:29:35

Neo2000

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3楼: Originally posted by sxy900803 at 2014-04-08 18:29:35
最左边的是Maker,之前师姐都是用的这对引物都是可以的，也不知道问题出在哪，都做了好久的实验了，啥结果都还没，急死人了
...

PCR程序有问题没？

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4楼2014-04-08 18:36:03

zh10246

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用PLASMID做阳性对照

5楼2014-04-08 19:12:11

lairongpeng

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1.体系有问题，10μl的体系都超了，还有，既然是10ul体系为什么buffer要加5ul ? 2.你这是目的片段连T载体转化挑单克隆摇菌后的PCR把？为什么要用t载体的通用引物？不用目的片段的引物？3.做一个阳性和阴性对照吧？4如果以上都不行，说明你的目的条带没有连上T载体。

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6楼2014-04-08 19:55:29

lairongpeng

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6楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-08 19:55:29
1.体系有问题，10μl的体系都超了，还有，既然是10ul体系为什么buffer要加5ul ? 2.你这是目的片段连T载体转化挑单克隆摇菌后的PCR把？为什么要用t载体的通用引物？不用目的片段的引物？3.做一个阳性和阴性对照吧？4 ...

感觉你不怎么理解pcr的原理，和T载体上的引物位置。

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7楼2014-04-08 19:58:12

电魂

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给你两点建议：1，改变你的PCR体系为20ul，10xPCR Buffer加2ul（1xPCR Buffer为工作浓度），菌液加2ul就够了（你的点样孔这么亮就是模版加多了），最后加水补足至20ul。你开始的体系问题很大。2，PMD-19T好像没有RV-M的引物结合位点吧，你换成M13+（-47）和M13-（-48）多好，也可以用PCR扩增引物看是否能扩出目的条带。

8楼2014-04-08 21:37:31