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闻人智颖

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[求助] 大神救命！！！菌液PCR 出来酶切质粒没有目的条带已有1人参与

如题，我挑单菌落加10ul水稀释后，取6ul当模板，PCR检出目的条带，但是把剩下的4ul 划线，摇菌后提质粒酶切没有切到目的片段，反反复复做了两个多月了，眼看就快毕不了业了，求大神支招啊！！！
图1：

图2：http://img01.taobaocdn.com/imgextra/i1/398212692/T2h21uXydaXXXXXXXX_!!398212692.jpg
图3：http://img04.taobaocdn.com/imgextra/i4/398212692/T2uNKCXzxXXXXXXXXX_!!398212692.jpg

T载体2700bp左右，目的片段：1300左右

各个图首道为MAKER(200bp ladder，最亮的为1000bp，最大的为4000) 第一个图的第二道是目的片段，后面四个为双酶切。第二个图为菌液PCR，前面4个中2,3；后面5个种1，4为目的片段（maker道除外），最后一道为含目的片段的质粒。用该4个出来目的片段的菌液摇菌后提质粒双酶切，最后一个图前面5个是另外挑的一批单克隆菌液PCR（maker 道除外），然后中间比较淡的4个为上一图的质粒双酶切，接下四个为分别单酶切，最后两个为不作处理的质粒。，

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1楼 2013-12-16 21:35:01

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gyesang

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【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-17 09:57:47

估计你的菌落PCR做的有问题：
1. 挑取菌落稀释在20ul 水中

2. 取2ul做模板，做菌落PCR

3. 菌落PCR的引物，最好选用载体上的一条+基因特异引物一条，或者上下游引物都是载体上的，如果两条引物都是基因特异引物很有可能会出现假阳性，就会出现你这样的，PCR有条带，抽质粒酶切不出来

4. PCR程序第一步预变性延长为5min

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2楼2013-12-16 21:53:52

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引用回帖:

2楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-16 21:53:52
估计你的菌落PCR做的有问题：
1. 挑取菌落稀释在20ul 水中

2. 取2ul做模板，做菌落PCR

3. 菌落PCR的引物，最好选用载体上的一条+基因特异引物一条，或者上下游引物都是载体上的，如果两条引物都是基因特异引 ...

谢谢你，我第二图种2，3两个是用目的片段的引物扩出来的，后面1,4的为载体上的通用引物扩出来的，这样都出来了，照理来说假阳性不会这么严重的啊。菌液稀释在10ul中取2ul当模板没有扩出来。反应程序是：95° 5min,98° 2min 10s， 98° 20s, 53° 15s， 72° 1min30s，72°10min，4°保温，40循环。

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3楼2013-12-17 19:28:01

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