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lulushuo

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR后，质粒模板消失了，到底是什么原因啊？有没有遇到同样问题的同学啊？？

经过PCR循环后，线性质粒模板消失了，琼脂糖电泳跑不出来条带，是什么原因呢？所有试剂都是新的，枪头都是灭过菌的，为什么质粒就没了呢？并且做了对照，体系中只加线性质粒模板和buffer、ddH2O，PCR循环后也是没有了，难道是线性质粒不稳定，高温降解？有没有同学遇到过同样问题啊？求助求助啊！！补充一句，线性质粒模板是通过设计引物然后PCR、切胶回收获得的，浓度在100ng/ul左右，进行琼脂糖电泳验证，条带正常。希望PCR经验丰富的同学帮忙分析一下啊！感激不尽！
从左到右上样顺序：
Maker，PCR体系1，PCR体系2，只加质粒进行PCR循环-对照，回收完质粒直接上样

胶图.jpg
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1楼 2013-03-26 10:50:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lulushuo(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:50:01
用线性质粒做PCR的模板一般只加几pg，10ng一下的DNA很难从胶上看到，看不到PCR模板才是正常的体系吧。如果模板加太多可能影响PCR效果，甚至什么也P不出来。
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2楼2013-03-26 12:25:15
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lying09

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:50:09
模板加的量本身在体系中的量就很少，不然LZ可以直接将加入到体系中的模板量跑电泳看是否同样没有条带。看图上，第二条那个是引物自聚吧，可以检查下引物，改变下退火温度之类的。祝好运。
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3楼2013-03-26 15:00:23
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lulushuo

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-26 12:25:15
用线性质粒做PCR的模板一般只加几pg，10ng一下的DNA很难从胶上看到，看不到PCR模板才是正常的体系吧。如果模板加太多可能影响PCR效果，甚至什么也P不出来。

谢谢回复~~我做的是插入片段和载体互为模板，载体有上百ng呢，应该是能看到的；就说第4孔吧，和第5孔只差没经历PCR程序，为啥就没了呢，可是等量上样啊。。。不解啊！
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4楼2013-03-26 16:30:19
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lulushuo

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lying09 at 2013-03-26 15:00:23
模板加的量本身在体系中的量就很少，不然LZ可以直接将加入到体系中的模板量跑电泳看是否同样没有条带。看图上，第二条那个是引物自聚吧，可以检查下引物，改变下退火温度之类的。祝好运。

谢谢回复~~我做的是插入片段和载体互为模板，载体有上百ng呢，应该是能看到的，2道和3道的可见条带是不同的插入片段；就说第4孔吧，和第5孔只差没经历PCR程序，为啥就没了呢，可是等量上样啊。。。求解啊！
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5楼2013-03-26 16:34:46
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