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lulushuo

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR后,质粒模板消失了,到底是什么原因啊?有没有遇到同样问题的同学啊??

经过PCR循环后,线性质粒模板消失了,琼脂糖电泳跑不出来条带,是什么原因呢?所有试剂都是新的,枪头都是灭过菌的,为什么质粒就没了呢?并且做了对照,体系中只加线性质粒模板和buffer、ddH2O,PCR循环后也是没有了,难道是线性质粒不稳定,高温降解?有没有同学遇到过同样问题啊?求助求助啊!!补充一句,线性质粒模板是通过设计引物然后PCR、切胶回收获得的,浓度在100ng/ul左右,进行琼脂糖电泳验证,条带正常。希望PCR经验丰富的同学帮忙分析一下啊!感激不尽!
从左到右上样顺序:
Maker,PCR体系1,PCR体系2,只加质粒进行PCR循环-对照,回收完质粒直接上样

胶图.jpg
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lulushuo

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-26 12:25:15
用线性质粒做PCR的模板一般只加几pg,10ng一下的DNA很难从胶上看到,看不到PCR模板才是正常的体系吧。如果模板加太多可能影响PCR效果,甚至什么也P不出来。

谢谢回复~~我做的是插入片段和载体互为模板,载体有上百ng呢,应该是能看到的;就说第4孔吧,和第5孔只差没经历PCR程序,为啥就没了呢,可是等量上样啊。。。不解啊!
4楼2013-03-26 16:30:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lulushuo(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-04-27 14:50:01
用线性质粒做PCR的模板一般只加几pg,10ng一下的DNA很难从胶上看到,看不到PCR模板才是正常的体系吧。如果模板加太多可能影响PCR效果,甚至什么也P不出来。
2楼2013-03-26 12:25:15
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lying09

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-04-27 14:50:09
模板加的量本身在体系中的量就很少,不然LZ可以直接将加入到体系中的模板量跑电泳看是否同样没有条带。看图上,第二条那个是引物自聚吧,可以检查下引物,改变下退火温度之类的。祝好运。
3楼2013-03-26 15:00:23
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lulushuo

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lying09 at 2013-03-26 15:00:23
模板加的量本身在体系中的量就很少,不然LZ可以直接将加入到体系中的模板量跑电泳看是否同样没有条带。看图上,第二条那个是引物自聚吧,可以检查下引物,改变下退火温度之类的。祝好运。

谢谢回复~~我做的是插入片段和载体互为模板,载体有上百ng呢,应该是能看到的,2道和3道的可见条带是不同的插入片段;就说第4孔吧,和第5孔只差没经历PCR程序,为啥就没了呢,可是等量上样啊。。。求解啊!
5楼2013-03-26 16:34:46
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