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小番茄

金虫 (小有名气)

[求助] PCR回收产物做PCR模板,为什么扩不出来 已有1人参与

请教各位虫子,是否模板加多了,PCR也会扩增不出条带?
我用质粒为模板,选用一对引物扩增目的片段,胶回收,第二次想再扩增目的片段,就直接用胶回收的产物(2μL跑电泳比较亮),稀释10倍后加了0.5μL ,但是没有目的条带,再用质粒做模板就能扩增出来,是我模板加多了吗?请教各位虫有!
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-07-15 19:46:20
小番茄: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-17 09:57:54
二次pcr扩增不出条带来挺正常的,这与引物的结合效率有关,当然也可能是elution buffer中的离子抑制了pcr反应,建议用无菌水洗脱,还有,最好是优化一下pcr条件,一次多p几管,多回收,避免二次pcr
coasttocoast。
3楼2012-07-15 12:41:05
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普通回帖

jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-16 13:40:35
小番茄: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-17 09:57:45
首先你得确认一下两次用的引物是一样的;然后确定一下你的胶回收过程有没有问题,回收完之后,你可以跑胶检测一下,如果没有条带,可能你的回收过程有问题,如果有,你最好确定一下到底是不是你的目的产物;最后就是你的模板浓度可能是稍微有点高,你可以稀释100倍,去1μl做模板,多想想办法吧,相信实验一定会做出来的
2楼2012-07-15 11:58:13
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-16 13:40:52
根据我自己的经验,就是模版太多了,我用PCR产物做模版时,都是最少稀释50倍,然后加0.5uL。所以建议你将PCR产物多稀释几个梯度后再做。
4楼2012-07-15 14:14:39
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野草倚南墙

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-16 13:41:03
楼主,根据我的经验,(我通常用试剂盒收产物30μl)在确定pcr产物回收没问题,点检大小和亮度正常,建议楼主直接取2μlpcr产物在100体系下扩增。按原来条件试一试,因该会有。
5楼2012-07-15 23:34:06
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84146922

金虫 (小有名气)

二次PCR效果不如一次PCR好,引物的结合效率不高,建议多P几管.
6楼2012-07-16 08:36:37
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7楼2012-11-30 15:24:44
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身未动

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 84146922 at 2012-07-16 08:36:37
二次PCR效果不如一次PCR好,引物的结合效率不高,建议多P几管.

请教;为什么引物结合效率会降低?
天道酬勤
8楼2014-09-21 23:44:58
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小傻瓜@静子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般胶回收回收成20μl,可以直接拿来PCR,加的时候加0.5μl作为模板,是没有问题的
9楼2014-09-22 14:47:56
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