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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR回收产物做PCR模板，为什么扩不出来
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小番茄

金虫 (小有名气)

[求助] PCR回收产物做PCR模板，为什么扩不出来 已有1人参与

请教各位虫子，是否模板加多了，PCR也会扩增不出条带？
我用质粒为模板，选用一对引物扩增目的片段，胶回收，第二次想再扩增目的片段，就直接用胶回收的产物（2μL跑电泳比较亮），稀释10倍后加了0.5μL ，但是没有目的条带，再用质粒做模板就能扩增出来，是我模板加多了吗？请教各位虫有!
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1楼 2012-07-15 11:23:02
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-16 13:40:35
小番茄: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-17 09:57:45
首先你得确认一下两次用的引物是一样的；然后确定一下你的胶回收过程有没有问题，回收完之后，你可以跑胶检测一下，如果没有条带，可能你的回收过程有问题，如果有，你最好确定一下到底是不是你的目的产物；最后就是你的模板浓度可能是稍微有点高，你可以稀释100倍，去1μl做模板，多想想办法吧，相信实验一定会做出来的
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2楼2012-07-15 11:58:13
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-07-15 19:46:20
小番茄: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-17 09:57:54
二次pcr扩增不出条带来挺正常的，这与引物的结合效率有关，当然也可能是elution buffer中的离子抑制了pcr反应，建议用无菌水洗脱，还有，最好是优化一下pcr条件，一次多p几管，多回收，避免二次pcr
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coasttocoast。
3楼2012-07-15 12:41:05
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-16 13:40:52
根据我自己的经验，就是模版太多了，我用PCR产物做模版时，都是最少稀释50倍，然后加0.5uL。所以建议你将PCR产物多稀释几个梯度后再做。
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4楼2012-07-15 14:14:39
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野草倚南墙

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-16 13:41:03
楼主，根据我的经验，（我通常用试剂盒收产物30μl）在确定pcr产物回收没问题，点检大小和亮度正常，建议楼主直接取2μlpcr产物在100体系下扩增。按原来条件试一试，因该会有。
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5楼2012-07-15 23:34:06
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84146922

金虫 (小有名气)
二次PCR效果不如一次PCR好，引物的结合效率不高，建议多P几管.
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6楼2012-07-16 08:36:37
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Richard_TXC
7楼2012-11-30 15:24:44
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身未动

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 84146922 at 2012-07-16 08:36:37
二次PCR效果不如一次PCR好，引物的结合效率不高，建议多P几管.

请教;为什么引物结合效率会降低？
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天道酬勤
8楼2014-09-21 23:44:58
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小傻瓜@静子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般胶回收回收成20μl，可以直接拿来PCR，加的时候加0.5μl作为模板，是没有问题的
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9楼2014-09-22 14:47:56
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