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jianghuifu

银虫 (初入文坛)

[求助] 相同条件的pcr产物,跑出不同的条带,是什么原因[/img][/img][/img]

这图为什么会有明暗不一样的,开始想可能与pcr产物的浓度有关,所以特意测了下浓度,结果好像又没什么很大关系,实在找不出原因,而且第十条有点弥散,是浓度太大啦,还是什么原因??还有就是前五条好像后面还有条带,这个又是什么原因??
注:前五条的加样体系为
10*buffer    3微升
BSA             1.2
L(引)    0.3
R(引)    0.3
taq               0.6
dNTP            0.8
DNA              1.0
ddH2O          补到30
后五条就是dNTP和DNA均为0.6,其他的一样。

从左边数起,前五条和后五条的加氧系统不一样,但pcr循环系统一样,而且是降落pcr



这个测的是pcr产物的浓度,这里的数据第一行是空白,接下来的十行和上面的十条条带一一对应,第一列为pcr产物的浓度,第三四五列分别是D260,D280,D260/D280值



线圈起来的里面隐隐约约可以看到条带,而后五条看不出来。
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有激情就释放
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你没有标明Marker的大小,不过底下的模糊条带应该是引物二聚体,明暗当然和PCR产物浓度有关了,之所以测出来没太大区别就是因为底下的引物二聚体造成的。至于每管都不一样,可能是PCR仪加热降温不一致造成的,

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2楼2012-03-05 07:24:33
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
加氧?我还以为你做的什么高级PCR。
这个我个人认为是引物的非特异扩增。但是为什么后面五个没有呢,这主要和DNA模版的量有关,前五个DNA模板的量是后五个的两倍左右,反映出来前五个有非特异扩增,后五个没有。这是因为非特异扩增和你的目的带比起来是弱势引物,在模板量不足的情况下,无法和模板结合,以至于没有扩增或者扩增很少。但是当模板量增大到一定程度,弱势引物也可以同时扩增,产生非特异条带。
希望能帮到你。
3楼2012-03-05 08:32:53
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我是战神把地

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的DNA模板量不浓度不均匀,而且每次加样的时候 会有一些误差在里面,建议你把条带不好的,重新做一次  注意:在吸取DNA模板的时候  尽量取表层样品。  祝好!!!!!!!!!!!
4楼2012-03-05 08:50:53
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by dnaxxx at 2012-03-05 07:24:33:
你没有标明Marker的大小,不过底下的模糊条带应该是引物二聚体,明暗当然和PCR产物浓度有关了,之所以测出来没太大区别就是因为底下的引物二聚体造成的。至于每管都不一样,可能是PCR仪加热降温不一致造成的,

引物二聚体的形成是因为引物浓度高吗,但后十条的引物浓度一样,而后五条的模板浓度还低些,如果是这样的话,不是后面五条的引物浓度的相对比值会更高些,更容易形成二聚体才是,郁闷啦,而且我这十管是一起p的,不是多批。跪求解答
有激情就释放
5楼2012-03-05 09:13:13
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eagle00768

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR仪里有的孔可能反应不均一,我们做PCR的时候偶尔也会出现这种问题,就是同时做的一批管,有的空能扩得好,有的扩不出来(加的东西完全一样),我觉得这是仪器的问题。另外,能看到引物二聚体是因为合成出来的产物少吧,就是可能你的DNA模版没能得到有效合成,剩下的引物多了就形成二聚体,合成效率高能充分利用引物了,那么形成的引物二聚体就少了。这是我个人的理解。

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6楼2012-03-05 09:19:41
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by yabxxh at 2012-03-05 08:32:53:
加氧?我还以为你做的什么高级PCR。
这个我个人认为是引物的非特异扩增。但是为什么后面五个没有呢,这主要和DNA模版的量有关,前五个DNA模板的量是后五个的两倍左右,反映出来前五个有非特异扩增,后五个没有。 ...

谢谢你的热心解答,可我还是有点疑惑,我上面的浓度是pcr产物的浓度,不是模板的浓度,模板的浓度在这里,2.2,  5.2, 9.5, 5.4, 10.3,后面五个和前面的五个模板是对应一样,其中第三个和第五个我特意稀释了一倍,好使模板浓度一直,第一个我就没办法稀释或浓缩啦,呵呵
有激情就释放
7楼2012-03-05 09:29:01
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by 我是战神把地 at 2012-03-05 08:50:53:
你的DNA模板量不浓度不均匀,而且每次加样的时候 会有一些误差在里面,建议你把条带不好的,重新做一次  注意:在吸取DNA模板的时候  尽量取表层样品。  祝好!!!!!!!!!!!

谢谢,我试试看
有激情就释放
8楼2012-03-05 09:29:19
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by eagle00768 at 2012-03-05 09:19:41:
PCR仪里有的孔可能反应不均一,我们做PCR的时候偶尔也会出现这种问题,就是同时做的一批管,有的空能扩得好,有的扩不出来(加的东西完全一样),我觉得这是仪器的问题。另外,能看到引物二聚体是因为合成出来的产 ...

这样分析有点道理,仪器我们之前还确实出现过这样的问题,下一个问题是,怎么去避免引物二聚体 的形成呢,也就是怎么提高合成率呢?
有激情就释放
9楼2012-03-05 10:41:08
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)

模板量不是越高越好,具体引物和模板的最佳比例没有仔细研究过,其实这没什么好纠结的,毕竟不是做定量PCR,能拿到你的目的片段就可以了。

PCR一般有12 x 8 个反应孔,你能保证每个孔加热降温都一致吗?所以PCR管尽量放置在中间位置,不要太靠外。

要减少引物二聚体的形成,最主要的就是在引物设计上,尽量减少链内或链间的互补,其次才是优化反应条件。
10楼2012-03-06 07:16:08
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