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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 相同条件的pcr产物，跑出不同的条带，是什么原因[/img][/img][/img]
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)

[求助] 相同条件的pcr产物，跑出不同的条带，是什么原因[/img][/img][/img]

这图为什么会有明暗不一样的，开始想可能与pcr产物的浓度有关，所以特意测了下浓度，结果好像又没什么很大关系，实在找不出原因，而且第十条有点弥散，是浓度太大啦，还是什么原因？？还有就是前五条好像后面还有条带，这个又是什么原因？？
注：前五条的加样体系为
10*buffer    3微升
BSA             1.2
L（引）    0.3
R（引）    0.3
taq               0.6
dNTP            0.8
DNA              1.0
ddH2O          补到30
后五条就是dNTP和DNA均为0.6，其他的一样。

从左边数起，前五条和后五条的加氧系统不一样，但pcr循环系统一样，而且是降落pcr



这个测的是pcr产物的浓度，这里的数据第一行是空白，接下来的十行和上面的十条条带一一对应，第一列为pcr产物的浓度，第三四五列分别是D260,D280，D260/D280值



线圈起来的里面隐隐约约可以看到条带，而后五条看不出来。
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有激情就释放
1楼 2012-03-05 01:14:51
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你没有标明Marker的大小，不过底下的模糊条带应该是引物二聚体，明暗当然和PCR产物浓度有关了，之所以测出来没太大区别就是因为底下的引物二聚体造成的。至于每管都不一样，可能是PCR仪加热降温不一致造成的，
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jianghuifu
2楼2012-03-05 07:24:33
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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加氧？我还以为你做的什么高级PCR。
这个我个人认为是引物的非特异扩增。但是为什么后面五个没有呢，这主要和DNA模版的量有关，前五个DNA模板的量是后五个的两倍左右，反映出来前五个有非特异扩增，后五个没有。这是因为非特异扩增和你的目的带比起来是弱势引物，在模板量不足的情况下，无法和模板结合，以至于没有扩增或者扩增很少。但是当模板量增大到一定程度，弱势引物也可以同时扩增，产生非特异条带。
希望能帮到你。
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3楼2012-03-05 08:32:53
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我是战神把地

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的DNA模板量不浓度不均匀，而且每次加样的时候 会有一些误差在里面，建议你把条带不好的，重新做一次  注意：在吸取DNA模板的时候  尽量取表层样品。  祝好！！！！！！！！！！！
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4楼2012-03-05 08:50:53
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by dnaxxx at 2012-03-05 07:24:33:
你没有标明Marker的大小，不过底下的模糊条带应该是引物二聚体，明暗当然和PCR产物浓度有关了，之所以测出来没太大区别就是因为底下的引物二聚体造成的。至于每管都不一样，可能是PCR仪加热降温不一致造成的，

引物二聚体的形成是因为引物浓度高吗，但后十条的引物浓度一样，而后五条的模板浓度还低些，如果是这样的话，不是后面五条的引物浓度的相对比值会更高些，更容易形成二聚体才是，郁闷啦，而且我这十管是一起p的，不是多批。跪求解答
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有激情就释放
5楼2012-03-05 09:13:13
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eagle00768

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR仪里有的孔可能反应不均一，我们做PCR的时候偶尔也会出现这种问题，就是同时做的一批管，有的空能扩得好，有的扩不出来（加的东西完全一样），我觉得这是仪器的问题。另外，能看到引物二聚体是因为合成出来的产物少吧，就是可能你的DNA模版没能得到有效合成，剩下的引物多了就形成二聚体，合成效率高能充分利用引物了，那么形成的引物二聚体就少了。这是我个人的理解。
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jianghuifu
6楼2012-03-05 09:19:41
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by yabxxh at 2012-03-05 08:32:53:
加氧？我还以为你做的什么高级PCR。
这个我个人认为是引物的非特异扩增。但是为什么后面五个没有呢，这主要和DNA模版的量有关，前五个DNA模板的量是后五个的两倍左右，反映出来前五个有非特异扩增，后五个没有。 ...

谢谢你的热心解答，可我还是有点疑惑，我上面的浓度是pcr产物的浓度，不是模板的浓度，模板的浓度在这里，2.2,  5.2， 9.5， 5.4， 10.3，后面五个和前面的五个模板是对应一样，其中第三个和第五个我特意稀释了一倍，好使模板浓度一直，第一个我就没办法稀释或浓缩啦，呵呵
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有激情就释放
7楼2012-03-05 09:29:01
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 我是战神把地 at 2012-03-05 08:50:53:
你的DNA模板量不浓度不均匀，而且每次加样的时候 会有一些误差在里面，建议你把条带不好的，重新做一次  注意：在吸取DNA模板的时候  尽量取表层样品。  祝好！！！！！！！！！！！

谢谢，我试试看
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有激情就释放
8楼2012-03-05 09:29:19
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jianghuifu

银虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by eagle00768 at 2012-03-05 09:19:41:
PCR仪里有的孔可能反应不均一，我们做PCR的时候偶尔也会出现这种问题，就是同时做的一批管，有的空能扩得好，有的扩不出来（加的东西完全一样），我觉得这是仪器的问题。另外，能看到引物二聚体是因为合成出来的产 ...

这样分析有点道理，仪器我们之前还确实出现过这样的问题，下一个问题是，怎么去避免引物二聚体 的形成呢，也就是怎么提高合成率呢？
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有激情就释放
9楼2012-03-05 10:41:08
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)
模板量不是越高越好，具体引物和模板的最佳比例没有仔细研究过，其实这没什么好纠结的，毕竟不是做定量PCR，能拿到你的目的片段就可以了。

PCR一般有12 x 8 个反应孔，你能保证每个孔加热降温都一致吗？所以PCR管尽量放置在中间位置，不要太靠外。

要减少引物二聚体的形成，最主要的就是在引物设计上，尽量减少链内或链间的互补，其次才是优化反应条件。
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10楼2012-03-06 07:16:08
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