应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大神救命！！！菌液PCR 出来酶切质粒没有目的条带
61/1返回列表
查看: 4566  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

闻人智颖

新虫 (初入文坛)

[求助] 大神救命！！！菌液PCR 出来酶切质粒没有目的条带 已有1人参与

如题，我挑单菌落加10ul水稀释后，取6ul当模板，PCR检出目的条带，但是把剩下的4ul 划线，摇菌后提质粒酶切没有切到目的片段，反反复复做了两个多月了，眼看就快毕不了业了，求大神支招啊！！！
图1：
图2：http://img01.taobaocdn.com/imgextra/i1/398212692/T2h21uXydaXXXXXXXX_!!398212692.jpg
图3：http://img04.taobaocdn.com/imgextra/i4/398212692/T2uNKCXzxXXXXXXXXX_!!398212692.jpg

T载体2700bp左右，目的片段：1300左右


   各个图首道为MAKER(200bp ladder，最亮的为1000bp，最大的为4000)  第一个图的第二道是目的片段，后面四个为双酶切。第二个图为菌液PCR，前面4个中2,3；后面5个种1，4为目的片段（maker道除外），最后一道为含目的片段的质粒。用该4个出来目的片段的菌液摇菌后提质粒双酶切，最后一个图前面5个是另外挑的一批单克隆菌液PCR（maker 道除外），然后中间比较淡的4个为上一图的质粒双酶切，接下四个为分别单酶切，最后两个为不作处理的质粒。，
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-12-16 21:35:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-17 09:57:47
估计你的菌落PCR做的有问题：
1. 挑取菌落稀释在20ul 水中

2. 取2ul做模板，做菌落PCR

3. 菌落PCR的引物，最好选用载体上的一条+基因特异引物一条，或者上下游引物都是载体上的，如果两条引物都是基因特异引物很有可能会出现假阳性，就会出现你这样的，PCR有条带，抽质粒酶切不出来

4. PCR程序第一步预变性延长为5min
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-12-16 21:53:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

闻人智颖

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-16 21:53:52
估计你的菌落PCR做的有问题：
1. 挑取菌落稀释在20ul 水中

2. 取2ul做模板，做菌落PCR

3. 菌落PCR的引物，最好选用载体上的一条+基因特异引物一条，或者上下游引物都是载体上的，如果两条引物都是基因特异引 ...

谢谢你，我第二图种2，3两个是用目的片段的引物扩出来的，后面1,4的为载体上的通用引物扩出来的，这样都出来了，照理来说假阳性不会这么严重 的啊。菌液稀释在10ul中取2ul当模板没有扩出来。反应程序是：95° 5min,98° 2min 10s， 98° 20s,  53°  15s，  72° 1min30s，72°10min，4°保温，40循环。
赞一下 回复此楼
3楼2013-12-17 19:28:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hitslu

银虫 (初入文坛)
我的情况跟LZ差不多啊，菌落pcr很亮，提质粒有三条带，酶切后质粒没有明显条带只有一段弥散状，郁闷死了，估计只能送去测序了
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-19 10:26:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

闻人智颖

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hitslu at 2013-12-19 10:26:00
我的情况跟LZ差不多啊，菌落pcr很亮，提质粒有三条带，酶切后质粒没有明显条带只有一段弥散状，郁闷死了，估计只能送去测序了

是啊，不知道是不是因为目的片段量太小的原因
赞一下 回复此楼
5楼2013-12-19 21:20:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小豆子J

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hitslu at 2013-12-19 10:26:00
我的情况跟LZ差不多啊，菌落pcr很亮，提质粒有三条带，酶切后质粒没有明显条带只有一段弥散状，郁闷死了，估计只能送去测序了

我每次都是菌液PCR之后没有条带，双酶切后有目的条带。
赞一下 回复此楼
6楼2014-07-07 14:30:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 闻人智颖 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 能否申诉？ +4 echo8914667 2026-08-30 4/200 2026-08-30 16:03 by sundiv
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-08-30 15:47 by xiangy672
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 14:05 by GkCVyODlx4mR
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 13:54 by GkCVyODlx4mR
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 6/300 2026-08-30 13:54 by GkCVyODlx4mR
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 11:30 by l0VvVHGBGRLv
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 07:39 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 06:22 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 13/650 2026-08-30 05:38 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +4 tannykie 2026-08-29 4/200 2026-08-29 17:14 by lmz0216
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭