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sxy900803

木虫 (小有名气)

[求助] 菌液PCR出现问题了 已有14人参与

本人最近做菌液PCR,老是没有目标条带,而是像图中所示那样,是为什么呢?求助大家,帮帮忙,很急!
我的是10ul的体系:Takara的Taq酶 0.25ul,
                               dNTP mixture 1ul,
                               10xPCR Buffer 5ul,
                               引物各1ul,加灭菌蒸馏水至10ul,
                               菌液4ul.
引物用的是PMD-19T载体的通用引物:RV-M和M13-47.
恳请遇到过类似情况的童鞋帮帮忙!谢谢大家了!

菌液PCR出现问题了
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lairongpeng

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.体系有问题,10μl的体系都超了,还有,既然是10ul体系为什么buffer要加5ul ? 2.你这是目的片段连T载体转化挑单克隆摇菌后的PCR把?为什么要用t载体的通用引物?不用目的片段的引物?3.做一个阳性和阴性对照吧?4如果以上都不行,说明你的目的条带没有连上T载体。

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2014-04-08 19:55:29
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ltfe567

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-08 17:26:18
最左侧的事DNA Marker 的条带吧?你这好像是出现非特异性条带了,是不是引物没选对呢?或者考虑下降落PCR,我也是新手,咱们互相交流
2楼2014-04-08 17:06:48
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sxy900803

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ltfe567 at 2014-04-08 17:06:48
最左侧的事DNA Marker 的条带吧?你这好像是出现非特异性条带了,是不是引物没选对呢?或者考虑下降落PCR,我也是新手,咱们互相交流

最左边的是Maker,之前师姐都是用的这对引物都是可以的,也不知道问题出在哪,都做了好久的实验了,啥结果都还没,急死人了

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-04-08 18:29:35
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by sxy900803 at 2014-04-08 18:29:35
最左边的是Maker,之前师姐都是用的这对引物都是可以的,也不知道问题出在哪,都做了好久的实验了,啥结果都还没,急死人了
...

PCR程序有问题没?

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-04-08 18:36:03
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