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媛媛yang

新虫 (初入文坛)

[交流] 农杆菌菌液PCR没有结果 已有6人参与

第一次菌液PCR,用农杆菌做菌液PCR,菌液1是保存在冰箱中一周,菌液2是新鲜摇的菌,3和4是质粒,结果,1,2,3没有条带,只有4有目的条带,且有很多杂带。目的条带800bp左右。
PCR条件是94℃,5min;
                 94℃,1min;
                  61℃,1min;
                  72℃,2min;
                 72℃,10min
请问是不是我的PCR条件有问题?请指教!
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

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reasonspare(金币+2): 谢谢分享 2011-04-27 11:32:17
引用回帖:
Originally posted by 媛媛yang at 2011-04-21 18:13:54:
今天重新做了菌液PCR,我把菌液100微升煮了15min,离心取上清,加样1微升,结果加样孔特别的亮,这种是什么情况?为什么每次都有新现象?
我的体系:
10*PCR Buffer     2.5
10mM dNTP          1
Taq        ...

你把菌液煮了蛋白也就出来了 加样孔是蛋白。你再看看我的回复, 自己重新摇下菌 4-5小时,用你构建载体时的程序,只是把预变性改成94℃ 10min  , 试试。还有体系20微升就可以了 BUFFER 2微升,过多的Mg离子也容易形成非特异条带
5楼2011-04-22 09:21:18
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

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amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-20 20:25:02
引用回帖:
Originally posted by 媛媛yang at 2011-04-20 17:22:22:
第一次菌液PCR,用农杆菌做菌液PCR,菌液1是保存在冰箱中一周,菌液2是新鲜摇的菌,3和4是质粒,结果,1,2,3没有条带,只有4有目的条带,且有很多杂带。目的条带800bp左右。
PCR条件是94℃,5min;
            ...

菌液PCR   一般摇4-5小时就可以做PCR了 取菌液1微升 你摇菌的时间多少?是不是摇的时间太长了 ?你取多少做模板 Pcr的?农杆菌有细胞壁不容易裂解,我一般是94℃,10min预变性的。菌液1是保存在冰箱中一周,是加了甘油在-20保存的?甘油影响PCR。目的条带800bp,72度延伸 1min30s足以。 不知这些对你是否有用?

[ Last edited by 小虫子666 on 2011-4-20 at 18:52 ]
2楼2011-04-20 18:49:57
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媛媛yang

新虫 (初入文坛)

今天重新做了菌液PCR,我把菌液100微升煮了15min,离心取上清,加样1微升,结果加样孔特别的亮,这种是什么情况?为什么每次都有新现象?
我的体系:
10*PCR Buffer     2.5
10mM dNTP          1
Taq                     0.2
10微M 引物1         1
引物2                   1
菌液                     1
水                       18.3
Total                    25
我的条件
94           10min
94            1min
61            1min
72            30sec
72            10min
30个循环
目的条带800bp左右,但是煮过的样品在marker最大条带后面有一个条带,marker最大的条带是1500,请问这是怎么回事?这个条带是怎么回事呢?
请指教!请指教!
3楼2011-04-21 18:13:54
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媛媛yang

新虫 (初入文坛)

有做农杆菌菌液PCR的同学吗?
4楼2011-04-22 00:05:18
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aga0110125

银虫 (小有名气)


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转农杆菌后,质粒拷贝会比大肠杆菌的少很多,我们一般不直接菌液PCR,而是提质粒,再PCR
6楼2011-04-22 11:20:04
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zgb1982

木虫 (正式写手)


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不是很难啊,我们都是直接粘一点菌落做模板PCR的,按正常的PCR程序也能扩出来的,不放心可以94度多预热会儿
7楼2011-04-27 10:58:51
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zgb1982

木虫 (正式写手)


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或者你退火降一点,延伸45秒试下撒
8楼2011-04-27 11:01:31
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gaoyang636

木虫 (著名写手)


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加样孔是蛋白~ 我觉得 aga0110125 同学说的很有道理哈~鼓掌
9楼2011-04-27 11:27:52
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张亚林0208

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
经常出现这种情况。
10楼2013-12-25 15:11:55
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