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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 农杆菌菌液PCR没有结果
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媛媛yang

新虫 (初入文坛)

[交流] 农杆菌菌液PCR没有结果已有6人参与

第一次菌液PCR，用农杆菌做菌液PCR,菌液1是保存在冰箱中一周，菌液2是新鲜摇的菌，3和4是质粒，结果，1，2，3没有条带，只有4有目的条带，且有很多杂带。目的条带800bp左右。
PCR条件是94℃，5min;
                 94℃，1min;
                  61℃，1min;
                  72℃，2min;
                 72℃，10min
请问是不是我的PCR条件有问题？请指教！
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1楼2011-04-20 17:22:22
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
reasonspare(金币+2): 谢谢分享 2011-04-27 11:32:17
引用回帖:
Originally posted by 媛媛yang at 2011-04-21 18:13:54:
今天重新做了菌液PCR，我把菌液100微升煮了15min，离心取上清，加样1微升，结果加样孔特别的亮，这种是什么情况？为什么每次都有新现象？
我的体系：
10*PCR Buffer     2.5
10mM dNTP          1
Taq        ...

你把菌液煮了蛋白也就出来了 加样孔是蛋白。你再看看我的回复， 自己重新摇下菌 4-5小时，用你构建载体时的程序，只是把预变性改成94℃ 10min  ， 试试。还有体系20微升就可以了 BUFFER 2微升，过多的Mg离子也容易形成非特异条带
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5楼2011-04-22 09:21:18
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-20 20:25:02
引用回帖:
Originally posted by 媛媛yang at 2011-04-20 17:22:22:
第一次菌液PCR，用农杆菌做菌液PCR,菌液1是保存在冰箱中一周，菌液2是新鲜摇的菌，3和4是质粒，结果，1，2，3没有条带，只有4有目的条带，且有很多杂带。目的条带800bp左右。
PCR条件是94℃，5min;
            ...

菌液PCR   一般摇4-5小时就可以做PCR了 取菌液1微升 你摇菌的时间多少？是不是摇的时间太长了 ？你取多少做模板 Pcr的？农杆菌有细胞壁不容易裂解，我一般是94℃，10min预变性的。菌液1是保存在冰箱中一周，是加了甘油在-20保存的？甘油影响PCR。目的条带800bp，72度延伸 1min30s足以。 不知这些对你是否有用？

[ Last edited by 小虫子666 on 2011-4-20 at 18:52 ]
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2楼2011-04-20 18:49:57
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媛媛yang

新虫 (初入文坛)
今天重新做了菌液PCR，我把菌液100微升煮了15min，离心取上清，加样1微升，结果加样孔特别的亮，这种是什么情况？为什么每次都有新现象？
我的体系：
10*PCR Buffer     2.5
10mM dNTP          1
Taq                     0.2
10微M 引物1         1
引物2                   1
菌液                     1
水                       18.3
Total                    25
我的条件
94           10min
94            1min
61            1min
72            30sec
72            10min
30个循环
目的条带800bp左右，但是煮过的样品在marker最大条带后面有一个条带，marker最大的条带是1500，请问这是怎么回事？这个条带是怎么回事呢？
请指教！请指教！
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3楼2011-04-21 18:13:54
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媛媛yang

新虫 (初入文坛)
有做农杆菌菌液PCR的同学吗？
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4楼2011-04-22 00:05:18
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aga0110125

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
转农杆菌后，质粒拷贝会比大肠杆菌的少很多，我们一般不直接菌液PCR，而是提质粒，再PCR
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6楼2011-04-22 11:20:04
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
不是很难啊，我们都是直接粘一点菌落做模板PCR的，按正常的PCR程序也能扩出来的，不放心可以94度多预热会儿
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7楼2011-04-27 10:58:51
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
或者你退火降一点，延伸45秒试下撒
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8楼2011-04-27 11:01:31
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
★
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加样孔是蛋白～ 我觉得 aga0110125 同学说的很有道理哈～鼓掌
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9楼2011-04-27 11:27:52
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张亚林0208

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
经常出现这种情况。
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10楼2013-12-25 15:11:55
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