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billy8580

新虫 (初入文坛)

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[交流] 请教：菌液pcr带总是很弱，为什么？已有3人参与

各位战友们，
我p一个基因，回收连接转化，挑菌摇菌，做菌液pcr鉴定，不知道为什么，每次菌液pcr的带很弱很弱，不仔细看，都看不出来，我就选了一管菌液测序，测出的结果是正确的，是我想要的东西。这整个流程已经重复四次了，每次都是这样，不知为什么？菌液摇的也很浓，pcr循环数都在30以上，我p其他片段时，从来没有这种现象。请问这是什么情况？

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1楼2011-07-10 22:47:19

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雨中的雕塑

银虫 (小有名气)

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1949stone: 手机回复鼓励 2011-07-11 10:14:16

胶浓度有关。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

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我愿天下人：人人得以智慧之光，去开启生命之真谛

2楼2011-07-11 07:48:16

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天使托

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T.Shen

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(EPI+1): 给力的天使 2011-07-11 10:13:51

弱没有关系，只要有而且测序准确就没有什么问题；
你PCR结果很弱可能原因有以下几点（个人分析）：
1：菌的浓度太大了，导致酶的作用部分丧失，这完全有可能；
2：PCR体系不合适；
3：退火温度的选择不当，这一点很有可能的，因为你循环次数都30次以上了，如果退火温度选择合适，我觉得应该是比较亮的；
4：延伸时间的选择，不知道你的片段多大？如果大片段，你延伸的时间段也会出现条带弱的情况的。

所以自己慢慢一步一步找原因，然后解决问题，加油！