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billy8580

新虫 (初入文坛)

[交流] 请教:菌液pcr带总是很弱,为什么?已有3人参与

各位战友们,
     我p一个基因,回收连接转化,挑菌摇菌,做菌液pcr鉴定,不知道为什么,每次菌液pcr的带很弱很弱,不仔细看,都看不出来,我就选了一管菌液测序,测出的结果是正确的,是我想要的东西。这整个流程已经重复四次了,每次都是这样,不知为什么?菌液摇的也很浓,pcr循环数都在30以上,我p其他片段时,从来没有这种现象。请问这是什么情况?
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
1949stone(EPI+1): 给力的天使 2011-07-11 10:13:51
弱没有关系,只要有而且测序准确就没有什么问题;
你PCR结果很弱可能原因有以下几点(个人分析):
1:菌的浓度太大了,导致酶的作用部分丧失,这完全有可能;
2:PCR体系不合适;
3:退火温度的选择不当,这一点很有可能的,因为你循环次数都30次以上了,如果退火温度选择合适,我觉得应该是比较亮的;
4:延伸时间的选择,不知道你的片段多大?如果大片段,你延伸的时间段也会出现条带弱的情况的。

所以自己慢慢一步一步找原因,然后解决问题,加油!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-07-11 09:12:02
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