应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR出现问题了
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
241/3返回列表123下一页
查看: 4094  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

sxy900803

木虫 (小有名气)

[求助] 菌液PCR出现问题了 已有14人参与

本人最近做菌液PCR，老是没有目标条带，而是像图中所示那样，是为什么呢？求助大家，帮帮忙，很急！
我的是10ul的体系：Takara的Taq酶 0.25ul,
                               dNTP mixture 1ul,
                               10xPCR Buffer 5ul,
                               引物各1ul,加灭菌蒸馏水至10ul,
                               菌液4ul.
引物用的是PMD-19T载体的通用引物：RV-M和M13-47.
恳请遇到过类似情况的童鞋帮帮忙！谢谢大家了！

菌液PCR出现问题了
}Z47[FAC0SFFJ`VZH4`J`_B.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-04-08 17:04:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你描述的体系就不对，如果你这样做，你的计算存在基本错误。

另外，我感觉你模板加的有点多，我之前做一般都是1ul的o/nculture，如果时间来得及，一般我会用水洗一遍菌，去除LB和代谢的产物。
赞一下(2人) 回复此楼
20楼2014-05-06 04:45:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

ltfe567

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-08 17:26:18
最左侧的事DNA Marker 的条带吧？你这好像是出现非特异性条带了，是不是引物没选对呢？或者考虑下降落PCR，我也是新手，咱们互相交流
赞一下 回复此楼
2楼2014-04-08 17:06:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxy900803

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ltfe567 at 2014-04-08 17:06:48
最左侧的事DNA Marker 的条带吧？你这好像是出现非特异性条带了，是不是引物没选对呢？或者考虑下降落PCR，我也是新手，咱们互相交流

最左边的是Maker,之前师姐都是用的这对引物都是可以的，也不知道问题出在哪，都做了好久的实验了，啥结果都还没，急死人了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2014-04-08 18:29:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by sxy900803 at 2014-04-08 18:29:35
最左边的是Maker,之前师姐都是用的这对引物都是可以的，也不知道问题出在哪，都做了好久的实验了，啥结果都还没，急死人了
...

PCR程序有问题没？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2014-04-08 18:36:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用PLASMID做阳性对照
赞一下 回复此楼
5楼2014-04-08 19:12:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lairongpeng

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.体系有问题，10μl的体系都超了，还有，既然是10ul体系为什么buffer要加5ul ? 2.你这是目的片段连T载体转化挑单克隆摇菌后的PCR把？为什么要用t载体的通用引物？不用目的片段的引物？3.做一个阳性和阴性对照吧？4如果以上都不行，说明你的目的条带没有连上T载体。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2014-04-08 19:55:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lairongpeng

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-08 19:55:29
1.体系有问题，10μl的体系都超了，还有，既然是10ul体系为什么buffer要加5ul ? 2.你这是目的片段连T载体转化挑单克隆摇菌后的PCR把？为什么要用t载体的通用引物？不用目的片段的引物？3.做一个阳性和阴性对照吧？4 ...

感觉你不怎么理解pcr的原理，和T载体上的引物位置。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2014-04-08 19:58:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

电魂

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
给你两点建议：1，改变你的PCR体系为20ul，10xPCR Buffer加2ul（1xPCR Buffer为工作浓度），菌液加2ul就够了（你的点样孔这么亮就是模版加多了），最后加水补足至20ul。你开始的体系问题很大。2，PMD-19T好像没有RV-M的引物结合位点吧，你换成M13+（-47）和M13-（-48）多好，也可以用PCR扩增引物看是否能扩出目的条带。
赞一下 回复此楼
8楼2014-04-08 21:37:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

victorLeo

木虫 (小有名气)

General Frontier

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
阴性对照，阳性对照都设立好，marker 没出带是没加EB吧，目的片段不出有可能是引物特异性不好，或是模板浓度高了
赞一下 回复此楼
希望探讨，多谢指教，讨厌说教，更讨厌不懂装懂。
9楼2014-04-08 22:21:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

victorLeo

木虫 (小有名气)

General Frontier

【答案】应助回帖

体系不对扩增出的目的片段DNA浓度太低了，你在做个20ul 体系的看看，别忘了加阴性对照和阳性对照，你的图片上面显示的污染的可能性也很大。。。。。
赞一下 回复此楼
希望探讨，多谢指教，讨厌说教，更讨厌不懂装懂。
10楼2014-04-08 22:25:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sxy900803 的主题更新
241/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 食品工程专硕求调剂 +3 小张zxy张 2026-03-26 3/150 2026-03-27 01:14 by dgnhs
[考研] 321求调剂 +6 wasdssaa 2026-03-26 6/300 2026-03-26 20:57 by sanrepian
[考研] 327求调剂 +7 prayer13 2026-03-23 7/350 2026-03-26 20:48 by 不吃魚的貓
[考研] 303求调剂 +7 元夕元 2026-03-20 8/400 2026-03-26 20:38 by 不吃魚的貓
[考研] 求调剂 +8 Auroracx 2026-03-22 8/400 2026-03-26 19:55 by 不吃魚的貓
[考研] 化学工程085602 305分求调剂 +17 RichLi_ 2026-03-25 17/850 2026-03-26 19:44 by plmuchong
[考研] 340求调剂 +3 Amber00 2026-03-26 3/150 2026-03-26 18:57 by 不吃魚的貓
[考研] 352求调剂 +4 大米饭！ 2026-03-22 4/200 2026-03-26 16:40 by 不吃魚的貓
[考研] 0856调剂 +4 求求让我有书读� 2026-03-26 5/250 2026-03-26 15:54 by dick_runner
[考研] 085600 材料与化工 329分求调剂 +9 Mr. Z 2026-03-25 9/450 2026-03-26 10:36 by baoball
[考研] 一志愿天津大学339材料与化工求调剂 +3 江往卖鱼 2026-03-26 3/150 2026-03-26 09:42 by 王小欠i
[考研] 材料专硕 335 分求调剂 +4 拒绝冷暴力 2026-03-25 4/200 2026-03-25 18:45 by haxia
[考研] 0854电子信息求调剂 +7 α____ 2026-03-22 9/450 2026-03-25 13:37 by α____
[考研] 284求调剂 +15 Zhao anqi 2026-03-22 15/750 2026-03-25 12:51 by wht0531
[考研] B区考研调剂 +4 yqdszhdap－ 2026-03-22 5/250 2026-03-25 08:51 by baoball
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
[考研] 284求调剂 +3 yanzhixue111 2026-03-23 6/300 2026-03-23 22:58 by pswait
[考研] 333求调剂 +3 ALULU4408 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:04 by macy2011
[考研] 293求调剂 +3 涛涛Wjt 2026-03-22 5/250 2026-03-22 22:21 by jiangpengfei
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭