应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR出现问题了
242/3返回列表上一页123下一页
查看: 4087  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.菌液PCR鉴定，我一般用25ul Taq体系扩增，
  Buffer 2.5ul，Mg+ 2ul，引物各1ul，dNTP  0.5ul，Taq酶 0.5ul，模版2ul，其余补水。
  需要注意的是，你的加样量要合理，也可以参照说明书上药品用量范围或者其他人平时使用的用量
2.引物是否正确？PCR条件是否合理？
3.注意操作中尽量避免污染，包括药品之间的交叉污染
4.另外，不知道会不会可能是挑出的菌根本不是你想要的，也要追溯一下前几步实验的合理性
赞一下 回复此楼
11楼2014-04-09 21:17:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

achillesyao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好用20微升体系，10微升体系，PCR管盖子不严，容易挥发，体系改变很大。另外，你的菌液里面有培养基，培养基的成分干扰了PCR。可以先离心去除培养基，用灭菌的dd水重悬，在抽1微升加入20微升体系里面作为模版。
赞一下 回复此楼
12楼2014-04-11 10:17:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunlhw

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-08 19:58:12
感觉你不怎么理解pcr的原理，和T载体上的引物位置。
...

我觉得楼上说的很对呀，你觉得他怎么不懂了呀?
赞一下 回复此楼
13楼2014-04-11 10:29:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lairongpeng

银虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by sunlhw at 2014-04-11 10:29:42
我觉得楼上说的很对呀，你觉得他怎么不懂了呀?...

我就是楼上的呀！
回复此楼
14楼2014-04-11 12:10:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
亲 为什么要用载体的引物呢 你用你的目的基因引物PCR试试
建议更改体系 片段很大吗 PMD19-T还是很好连接的 1K-1.5K以内的
赞一下 回复此楼
15楼2014-04-11 13:12:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
10x的buffer你加这么多干嘛？另外，你用的buffer是自带镁离子的吗？有的buffer是要另加镁离子的。
赞一下 回复此楼
16楼2014-04-11 13:41:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunlhw

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-11 12:10:44
我就是楼上的呀！...

我就是说你呀，觉得你懂得很多呀，表扬一下你，难道你还不了解呀！
赞一下 回复此楼
17楼2014-04-11 15:52:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fanwq258

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

首先：10ul体系10xbuffer加 1ul吧 ，应该。然后，菌液4ul，太多了吧，最多1u就够了。最后 你给出的体系超出10u了吧。还有，你的胶跑得真不咋得。
赞一下 回复此楼
要么好好活，要么死，拒绝半死不活
18楼2014-04-11 17:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dispy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我确定肯定的告诉你就是菌液4ul，太多了，我之前出现和你一样的问题，换成1μ就可以，引物用特异引物
赞一下 回复此楼
19楼2014-05-06 00:31:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你描述的体系就不对，如果你这样做，你的计算存在基本错误。

另外，我感觉你模板加的有点多，我之前做一般都是1ul的o/nculture，如果时间来得及，一般我会用水洗一遍菌，去除LB和代谢的产物。
赞一下(2人) 回复此楼
20楼2014-05-06 04:45:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sxy900803 的主题更新
242/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿华理，数一英一285求A区调剂 +6 AZMK 2026-03-25 8/400 2026-03-26 21:22 by baoball
[考研] 0703化学求调剂 +3 丹青奶盖 2026-03-26 5/250 2026-03-26 20:11 by macy2011
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +17 tcxiaoxx 2026-03-20 19/950 2026-03-26 16:04 by 不吃魚的貓
[考研] 334分 一志愿武理 材料求调剂 +4 李李不服输 2026-03-26 4/200 2026-03-26 16:00 by 不吃魚的貓
[考研] 材料科学与工程 317求调剂 +4 JKSOIID 2026-03-26 4/200 2026-03-26 15:58 by 不吃魚的貓
[考研] 寻找调剂 +5 倔强芒? 2026-03-21 8/400 2026-03-26 13:25 by 0906ljy
[考研] 332求调剂 +6 032500 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:45 by 418490947
[考研] 求调剂 +3 李李不服输 2026-03-25 3/150 2026-03-25 13:03 by cmz0325
[考研] 0854电子信息求调剂 324 +4 Promise-jyl 2026-03-23 4/200 2026-03-25 11:36 by Sugarlight
[考研] 材料调剂 +3 iwinso 2026-03-23 3/150 2026-03-25 11:29 by greychen00
[考研] 318求调剂 +3 plum李子 2026-03-23 3/150 2026-03-25 09:42 by 雾散后相遇lc
[考研] 材料专硕找调剂 +5 哈哈哈吼吼吼哈 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:07 by 了了了了。。
[考研] 080500求调剂 +3 zzzzfan 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:38 by barlinike
[考研] 材料/农业专业，07/08开头均可，过线就行 +3 呵唔哦豁 2026-03-23 4/200 2026-03-23 22:30 by 汪！？！
[考研] 384求调剂 +3 子系博 2026-03-22 6/300 2026-03-23 21:45 by 子系博
[考研] 336化工调剂 +4 王大坦1 2026-03-23 5/250 2026-03-23 18:32 by allen-yin
[考研] 工科0856求调剂 +5 沐析汀汀 2026-03-21 5/250 2026-03-23 17:56 by 海瑟薇-
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:09 by 星空星月
[考研] 22408 344分 求调剂 一志愿 华电计算机技术 +4 solanXXX 2026-03-20 4/200 2026-03-20 23:49 by alg094825
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭