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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR出现问题了
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.菌液PCR鉴定，我一般用25ul Taq体系扩增，
  Buffer 2.5ul，Mg+ 2ul，引物各1ul，dNTP  0.5ul，Taq酶 0.5ul，模版2ul，其余补水。
  需要注意的是，你的加样量要合理，也可以参照说明书上药品用量范围或者其他人平时使用的用量
2.引物是否正确？PCR条件是否合理？
3.注意操作中尽量避免污染，包括药品之间的交叉污染
4.另外，不知道会不会可能是挑出的菌根本不是你想要的，也要追溯一下前几步实验的合理性
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11楼2014-04-09 21:17:31
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achillesyao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好用20微升体系，10微升体系，PCR管盖子不严，容易挥发，体系改变很大。另外，你的菌液里面有培养基，培养基的成分干扰了PCR。可以先离心去除培养基，用灭菌的dd水重悬，在抽1微升加入20微升体系里面作为模版。
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12楼2014-04-11 10:17:14
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sunlhw

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-08 19:58:12
感觉你不怎么理解pcr的原理，和T载体上的引物位置。
...

我觉得楼上说的很对呀，你觉得他怎么不懂了呀?
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13楼2014-04-11 10:29:42
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lairongpeng

银虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by sunlhw at 2014-04-11 10:29:42
我觉得楼上说的很对呀，你觉得他怎么不懂了呀?...

我就是楼上的呀！
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14楼2014-04-11 12:10:44
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sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
亲 为什么要用载体的引物呢 你用你的目的基因引物PCR试试
建议更改体系 片段很大吗 PMD19-T还是很好连接的 1K-1.5K以内的
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15楼2014-04-11 13:12:15
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draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
10x的buffer你加这么多干嘛？另外，你用的buffer是自带镁离子的吗？有的buffer是要另加镁离子的。
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16楼2014-04-11 13:41:23
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sunlhw

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-11 12:10:44
我就是楼上的呀！...

我就是说你呀，觉得你懂得很多呀，表扬一下你，难道你还不了解呀！
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17楼2014-04-11 15:52:03
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fanwq258

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

首先：10ul体系10xbuffer加 1ul吧 ，应该。然后，菌液4ul，太多了吧，最多1u就够了。最后 你给出的体系超出10u了吧。还有，你的胶跑得真不咋得。
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
18楼2014-04-11 17:43:19
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dispy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我确定肯定的告诉你就是菌液4ul，太多了，我之前出现和你一样的问题，换成1μ就可以，引物用特异引物
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19楼2014-05-06 00:31:17
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你描述的体系就不对，如果你这样做，你的计算存在基本错误。

另外，我感觉你模板加的有点多，我之前做一般都是1ul的o/nculture，如果时间来得及，一般我会用水洗一遍菌，去除LB和代谢的产物。
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20楼2014-05-06 04:45:31
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