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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.菌液PCR鉴定,我一般用25ul Taq体系扩增,
  Buffer 2.5ul,Mg+ 2ul,引物各1ul,dNTP  0.5ul,Taq酶 0.5ul,模版2ul,其余补水。
  需要注意的是,你的加样量要合理,也可以参照说明书上药品用量范围或者其他人平时使用的用量
2.引物是否正确?PCR条件是否合理?
3.注意操作中尽量避免污染,包括药品之间的交叉污染
4.另外,不知道会不会可能是挑出的菌根本不是你想要的,也要追溯一下前几步实验的合理性
11楼2014-04-09 21:17:31
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achillesyao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
最好用20微升体系,10微升体系,PCR管盖子不严,容易挥发,体系改变很大。另外,你的菌液里面有培养基,培养基的成分干扰了PCR。可以先离心去除培养基,用灭菌的dd水重悬,在抽1微升加入20微升体系里面作为模版。
12楼2014-04-11 10:17:14
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sunlhw

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-08 19:58:12
感觉你不怎么理解pcr的原理,和T载体上的引物位置。
...

我觉得楼上说的很对呀,你觉得他怎么不懂了呀?
13楼2014-04-11 10:29:42
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lairongpeng

银虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by sunlhw at 2014-04-11 10:29:42
我觉得楼上说的很对呀,你觉得他怎么不懂了呀?...

我就是楼上的呀!
14楼2014-04-11 12:10:44
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sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
亲 为什么要用载体的引物呢 你用你的目的基因引物PCR试试
建议更改体系 片段很大吗 PMD19-T还是很好连接的 1K-1.5K以内的
15楼2014-04-11 13:12:15
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draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
10x的buffer你加这么多干嘛?另外,你用的buffer是自带镁离子的吗?有的buffer是要另加镁离子的。
16楼2014-04-11 13:41:23
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sunlhw

木虫 (著名写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-11 12:10:44
我就是楼上的呀!...

我就是说你呀,觉得你懂得很多呀,表扬一下你,难道你还不了解呀!
17楼2014-04-11 15:52:03
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fanwq258

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

首先:10ul体系10xbuffer加 1ul吧 ,应该。然后,菌液4ul,太多了吧,最多1u就够了。最后 你给出的体系超出10u了吧。还有,你的胶跑得真不咋得。
要么好好活,要么死,拒绝半死不活
18楼2014-04-11 17:43:19
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dispy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我确定肯定的告诉你就是菌液4ul,太多了,我之前出现和你一样的问题,换成1μ就可以,引物用特异引物
19楼2014-05-06 00:31:17
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你描述的体系就不对,如果你这样做,你的计算存在基本错误。

另外,我感觉你模板加的有点多,我之前做一般都是1ul的o/nculture,如果时间来得及,一般我会用水洗一遍菌,去除LB和代谢的产物。
20楼2014-05-06 04:45:31
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