应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR出现问题了
242/3返回列表上一页123下一页
查看: 4812  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.菌液PCR鉴定，我一般用25ul Taq体系扩增，
  Buffer 2.5ul，Mg+ 2ul，引物各1ul，dNTP  0.5ul，Taq酶 0.5ul，模版2ul，其余补水。
  需要注意的是，你的加样量要合理，也可以参照说明书上药品用量范围或者其他人平时使用的用量
2.引物是否正确？PCR条件是否合理？
3.注意操作中尽量避免污染，包括药品之间的交叉污染
4.另外，不知道会不会可能是挑出的菌根本不是你想要的，也要追溯一下前几步实验的合理性
赞一下 回复此楼
11楼2014-04-09 21:17:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

achillesyao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好用20微升体系，10微升体系，PCR管盖子不严，容易挥发，体系改变很大。另外，你的菌液里面有培养基，培养基的成分干扰了PCR。可以先离心去除培养基，用灭菌的dd水重悬，在抽1微升加入20微升体系里面作为模版。
赞一下 回复此楼
12楼2014-04-11 10:17:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunlhw

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-08 19:58:12
感觉你不怎么理解pcr的原理，和T载体上的引物位置。
...

我觉得楼上说的很对呀，你觉得他怎么不懂了呀?
赞一下 回复此楼
13楼2014-04-11 10:29:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lairongpeng

银虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by sunlhw at 2014-04-11 10:29:42
我觉得楼上说的很对呀，你觉得他怎么不懂了呀?...

我就是楼上的呀！
回复此楼
14楼2014-04-11 12:10:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
亲 为什么要用载体的引物呢 你用你的目的基因引物PCR试试
建议更改体系 片段很大吗 PMD19-T还是很好连接的 1K-1.5K以内的
赞一下 回复此楼
15楼2014-04-11 13:12:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
10x的buffer你加这么多干嘛？另外，你用的buffer是自带镁离子的吗？有的buffer是要另加镁离子的。
赞一下 回复此楼
16楼2014-04-11 13:41:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunlhw

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-11 12:10:44
我就是楼上的呀！...

我就是说你呀，觉得你懂得很多呀，表扬一下你，难道你还不了解呀！
赞一下 回复此楼
17楼2014-04-11 15:52:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fanwq258

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

首先：10ul体系10xbuffer加 1ul吧 ，应该。然后，菌液4ul，太多了吧，最多1u就够了。最后 你给出的体系超出10u了吧。还有，你的胶跑得真不咋得。
赞一下 回复此楼
要么好好活，要么死，拒绝半死不活
18楼2014-04-11 17:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dispy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我确定肯定的告诉你就是菌液4ul，太多了，我之前出现和你一样的问题，换成1μ就可以，引物用特异引物
赞一下 回复此楼
19楼2014-05-06 00:31:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你描述的体系就不对，如果你这样做，你的计算存在基本错误。

另外，我感觉你模板加的有点多，我之前做一般都是1ul的o/nculture，如果时间来得及，一般我会用水洗一遍菌，去除LB和代谢的产物。
赞一下(2人) 回复此楼
20楼2014-05-06 04:45:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sxy900803 的主题更新
242/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 3/150 2026-09-14 18:01 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-14 17:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-14 17:25 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:12 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:00 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:57 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:45 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:37 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:13 by Aj1rhIDL5ixY
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 15:09 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:01 by Aj1rhIDL5ixY
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-14 15:00 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 14:57 by Aj1rhIDL5ixY
[基金申请] 求教各位大神：2026教育部人文社科青年基金项目何时公示呀？ +5 云宴山人 2026-09-10 7/350 2026-09-14 12:11 by ecnu2013
[找工作] 浙江师范大学是怎么坑我的 +6 recruit123 2026-09-09 6/300 2026-09-14 12:00 by 萨仁其其格
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 10:01 by 23jxep3nCNZb
[考博] 西北工业大学材料学院电化学传感与催化课题组招收2027年推免研究生、博士生、博士后 +3 马方园 2026-09-10 4/200 2026-09-14 09:29 by Chem张zz
[考博] 27秋季材料博士申请求助 10+3 Cahal1 2026-09-11 4/200 2026-09-14 08:50 by 北京莱茵编辑
[有机交流] 科研求助 10+4 我吃一只鱼 2026-09-07 4/200 2026-09-10 08:32 by 0940628
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭