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sxy900803

木虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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散金: 200
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在线: 135.2小时
虫号: 1245767
注册: 2011-03-26
性别: MM
专业: 环境工程

[求助] 菌液PCR出现问题了已有14人参与

本人最近做菌液PCR，老是没有目标条带，而是像图中所示那样，是为什么呢？求助大家，帮帮忙，很急！
我的是10ul的体系：Takara的Taq酶 0.25ul,
                           dNTP mixture 1ul,
                           10xPCR Buffer 5ul,
                           引物各1ul,加灭菌蒸馏水至10ul,
                           菌液4ul.
引物用的是PMD-19T载体的通用引物：RV-M和M13-47.
恳请遇到过类似情况的童鞋帮帮忙！谢谢大家了！

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1楼2014-04-08 17:04:31

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不爱做实验

银虫 (正式写手)

应助: 37 (小学生)
金币: 316.7
红花: 5
帖子: 399
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虫号: 3124215
注册: 2014-04-09
性别: GG
专业: 生物信息学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1.菌液PCR鉴定，我一般用25ul Taq体系扩增，
Buffer 2.5ul，Mg+ 2ul，引物各1ul，dNTP 0.5ul，Taq酶 0.5ul，模版2ul，其余补水。
需要注意的是，你的加样量要合理，也可以参照说明书上药品用量范围或者其他人平时使用的用量
2.引物是否正确？PCR条件是否合理？
3.注意操作中尽量避免污染，包括药品之间的交叉污染
4.另外，不知道会不会可能是挑出的菌根本不是你想要的，也要追溯一下前几步实验的合理性