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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR出现问题了
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sxy900803

木虫 (小有名气)

[求助] 菌液PCR出现问题了 已有14人参与

本人最近做菌液PCR，老是没有目标条带，而是像图中所示那样，是为什么呢？求助大家，帮帮忙，很急！
我的是10ul的体系：Takara的Taq酶 0.25ul,
                               dNTP mixture 1ul,
                               10xPCR Buffer 5ul,
                               引物各1ul,加灭菌蒸馏水至10ul,
                               菌液4ul.
引物用的是PMD-19T载体的通用引物：RV-M和M13-47.
恳请遇到过类似情况的童鞋帮帮忙！谢谢大家了！

菌液PCR出现问题了
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1楼 2014-04-08 17:04:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你描述的体系就不对，如果你这样做，你的计算存在基本错误。

另外，我感觉你模板加的有点多，我之前做一般都是1ul的o/nculture，如果时间来得及，一般我会用水洗一遍菌，去除LB和代谢的产物。
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20楼2014-05-06 04:45:31
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普通回帖

ltfe567

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-08 17:26:18
最左侧的事DNA Marker 的条带吧？你这好像是出现非特异性条带了，是不是引物没选对呢？或者考虑下降落PCR，我也是新手，咱们互相交流
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2楼2014-04-08 17:06:48
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sxy900803

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ltfe567 at 2014-04-08 17:06:48
最左侧的事DNA Marker 的条带吧？你这好像是出现非特异性条带了，是不是引物没选对呢？或者考虑下降落PCR，我也是新手，咱们互相交流

最左边的是Maker,之前师姐都是用的这对引物都是可以的，也不知道问题出在哪，都做了好久的实验了，啥结果都还没，急死人了

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3楼2014-04-08 18:29:35
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by sxy900803 at 2014-04-08 18:29:35
最左边的是Maker,之前师姐都是用的这对引物都是可以的，也不知道问题出在哪，都做了好久的实验了，啥结果都还没，急死人了
...

PCR程序有问题没？

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4楼2014-04-08 18:36:03
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用PLASMID做阳性对照
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5楼2014-04-08 19:12:11
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lairongpeng

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.体系有问题，10μl的体系都超了，还有，既然是10ul体系为什么buffer要加5ul ? 2.你这是目的片段连T载体转化挑单克隆摇菌后的PCR把？为什么要用t载体的通用引物？不用目的片段的引物？3.做一个阳性和阴性对照吧？4如果以上都不行，说明你的目的条带没有连上T载体。

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6楼2014-04-08 19:55:29
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lairongpeng

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-08 19:55:29
1.体系有问题，10μl的体系都超了，还有，既然是10ul体系为什么buffer要加5ul ? 2.你这是目的片段连T载体转化挑单克隆摇菌后的PCR把？为什么要用t载体的通用引物？不用目的片段的引物？3.做一个阳性和阴性对照吧？4 ...

感觉你不怎么理解pcr的原理，和T载体上的引物位置。

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7楼2014-04-08 19:58:12
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电魂

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
给你两点建议：1，改变你的PCR体系为20ul，10xPCR Buffer加2ul（1xPCR Buffer为工作浓度），菌液加2ul就够了（你的点样孔这么亮就是模版加多了），最后加水补足至20ul。你开始的体系问题很大。2，PMD-19T好像没有RV-M的引物结合位点吧，你换成M13+（-47）和M13-（-48）多好，也可以用PCR扩增引物看是否能扩出目的条带。
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8楼2014-04-08 21:37:31
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victorLeo

木虫 (小有名气)

General Frontier

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
阴性对照，阳性对照都设立好，marker 没出带是没加EB吧，目的片段不出有可能是引物特异性不好，或是模板浓度高了
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希望探讨，多谢指教，讨厌说教，更讨厌不懂装懂。
9楼2014-04-08 22:21:49
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victorLeo

木虫 (小有名气)

General Frontier

【答案】应助回帖

体系不对扩增出的目的片段DNA浓度太低了，你在做个20ul 体系的看看，别忘了加阴性对照和阳性对照，你的图片上面显示的污染的可能性也很大。。。。。
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希望探讨，多谢指教，讨厌说教，更讨厌不懂装懂。
10楼2014-04-08 22:25:21
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