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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pMD-19T载体与目的片段的连接问题
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

[求助] pMD-19T载体与目的片段的连接问题已有6人参与

之前计划目的基因（3.6Kb）与pMD-19T进行TA克隆连接，目的片段用primerstar高保真酶后加A连接，氨苄板生长，鉴定后发现是载体自连；后来用Taq酶PCR扩增后直接与pMD-19T载体链接，最后发现还是自连的···发现这都不行后就进行一步克隆（ClonExpressTM快速克隆技术），之前认为在载体是线性的，就直接连了，但是没有连上，氨苄平板上没长；后来用以前构建好的质粒进行双酶切后进行一步克隆，可是氨苄平板上还是没有长···各位大神，求助···
转化条件：
感受态是自己用氯化钙法做的，以前也是用它来做转化，都可以的···
热击90s后，37℃活化1h后，将转化液浓缩全部涂平板···
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1楼2014-07-25 09:35:38
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
4楼: Originally posted by kuaile5420 at 2014-07-25 11:38:57
你用Taq DNA聚合酶进行PCR之后进行相应的酶切就直接连接载体了吗？

之前认为是Taq酶P出来就存在A尾，就直接连接了，发现载体自连了，后来P出来之后，又用加A试剂盒加A尾进行连接转化，鉴定后还是没连上···
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8楼2014-07-25 13:16:26
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-25 13:16:26
之前认为是Taq酶P出来就存在A尾，就直接连接了，发现载体自连了，后来P出来之后，又用加A试剂盒加A尾进行连接转化，鉴定后还是没连上···...

加A试剂盒不会有问题吧？转化后是怎么鉴定的啊？
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坚持到底就是胜利！
10楼2014-07-25 14:52:32
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sj082csh

银虫 (小有名气)
★
小冀-(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:01:44
你好，可能是你的目的片段太长了。。 建议您换一下连接体系。 PMD19-T中，T4连接酶在solution I 里，好像本身连接效率就不高，况且你的片段3.6K
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14楼2014-07-25 23:21:31
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 12:39:37
这是普通的酶切链接吧，我也在考虑做三个浓度梯度进行连接，以上我做的是一步克隆，都没有连上···...

你的不是加A了吗？   这样是可以的。就是TA克隆嘛
片段加3ul
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24楼2014-07-26 14:39:47
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小冀-: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-27 12:08:48
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 09:29:18
DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u...

你的目的基因这么大，DNA量加的不够。连接体系里的DNA分子数大概是载体量的3-5倍。你的片段和载体差不多一样大，那么你加入的DNA重量至少要是载体的三倍。建议你做个梯度，3:1，4:1，5:1这样。因为目的片段基本上和载体差不多大甚至比载体更大，连接会比较困难。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
26楼2014-07-26 17:30:40
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风灵之翼

金虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-29 16:06:17
给你个可以连接的方法，按照标准体系配置完成后，将反应体系放在4度冰箱的门上，门上温度大约在10度左右，连接过夜或者24小时，成功几率很大

[ 发自小木虫客户端 ]
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28楼2014-07-28 16:52:28
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普通回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 10:54:32
我觉得第一次做的比较好，因为第二次你没有纯化。
个人觉得是你连接体系出问题了，你可以把具体信息写下来给你看看。
热击90s后，要记得冰上5min，然后加SOC,再37度恢复培养。
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2楼2014-07-25 10:20:16
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接效率太低，PCR产物要纯化
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3楼2014-07-25 11:33:56
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用Taq DNA聚合酶进行PCR之后进行相应的酶切就直接连接载体了吗？
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坚持到底就是胜利！
4楼2014-07-25 11:38:57
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panhp2004

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 13:58:12
构建质粒的一般步骤：
扩增目的基因---PCR产物纯化，加17ul 洗脱液洗脱（PCR产物纯化试剂盒做）---双酶切，30或50ul 体系，纯化后的PCR产物取 10ul，载体取 3ul，37度 约3-4h---胶回收（胶回收试剂盒做），加17ul 洗脱液洗脱----连接，16度，约3-4h----转化，热激时，42度，40 s 即可----后培养，加200 ul  液体LB ，37度静止培养 1 h----取200 ul 涂氨苄。
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追梦是一个快乐的过程。
5楼2014-07-25 13:11:27
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小冀-

版主 (著名写手)

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引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-25 10:20:16
我觉得第一次做的比较好，因为第二次你没有纯化。
个人觉得是你连接体系出问题了，你可以把具体信息写下来给你看看。
热击90s后，要记得冰上5min，然后加SOC,再37度恢复培养。

纯化是什么意思？载体和目的片段都是跑胶回收的···热击后，我冰浴了2min，然后才活化的···
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6楼2014-07-25 13:13:11
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小冀-

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引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-25 11:33:56
连接效率太低，PCR产物要纯化

载体和目的片段都是跑胶回收过的，应该算是纯化了吧···
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7楼2014-07-25 13:14:06
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小冀-

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引用回帖:
5楼: Originally posted by panhp2004 at 2014-07-25 13:11:27
构建质粒的一般步骤：
扩增目的基因---PCR产物纯化，加17ul 洗脱液洗脱（PCR产物纯化试剂盒做）---双酶切，30或50ul 体系，纯化后的PCR产物取 10ul，载体取 3ul，37度 约3-4h---胶回收（胶回收试剂盒做），加17ul  ...

步骤我都知道的···
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9楼2014-07-25 13:17:33
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