应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pMD-19T载体与目的片段的连接问题
351/4返回列表1234下一页
查看: 5498  |  回复: 34
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

[求助] pMD-19T载体与目的片段的连接问题 已有6人参与

之前计划目的基因（3.6Kb）与pMD-19T进行TA克隆连接，目的片段用primerstar高保真酶后加A连接，氨苄板生长，鉴定后发现是载体自连；后来用Taq酶PCR扩增后直接与pMD-19T载体链接，最后发现还是自连的···发现这都不行后就进行一步克隆（ClonExpressTM快速克隆技术），之前认为在载体是线性的，就直接连了，但是没有连上，氨苄平板上没长；后来用以前构建好的质粒进行双酶切后进行一步克隆，可是氨苄平板上还是没有长···各位大神，求助···
转化条件：
感受态是自己用氯化钙法做的，以前也是用它来做转化，都可以的···
热击90s后，37℃活化1h后，将转化液浓缩全部涂平板···
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

重组的景区

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
···
1楼 2014-07-25 09:35:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sj082csh

银虫 (小有名气)
★
小冀-(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:01:44
你好，可能是你的目的片段太长了。。 建议您换一下连接体系。 PMD19-T中，T4连接酶在solution I 里，好像本身连接效率就不高，况且你的片段3.6K
赞一下(2人) 回复此楼
14楼2014-07-25 23:21:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 10:54:32
我觉得第一次做的比较好，因为第二次你没有纯化。
个人觉得是你连接体系出问题了，你可以把具体信息写下来给你看看。
热击90s后，要记得冰上5min，然后加SOC,再37度恢复培养。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2014-07-25 10:20:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
4楼: Originally posted by kuaile5420 at 2014-07-25 11:38:57
你用Taq DNA聚合酶进行PCR之后进行相应的酶切就直接连接载体了吗？

之前认为是Taq酶P出来就存在A尾，就直接连接了，发现载体自连了，后来P出来之后，又用加A试剂盒加A尾进行连接转化，鉴定后还是没连上···
赞一下(1人) 回复此楼
···
8楼2014-07-25 13:16:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kuaile5420

专家顾问 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-25 13:16:26
之前认为是Taq酶P出来就存在A尾，就直接连接了，发现载体自连了，后来P出来之后，又用加A试剂盒加A尾进行连接转化，鉴定后还是没连上···...

加A试剂盒不会有问题吧？转化后是怎么鉴定的啊？
赞一下(1人) 回复此楼
坚持到底就是胜利！
10楼2014-07-25 14:52:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 12:39:37
这是普通的酶切链接吧，我也在考虑做三个浓度梯度进行连接，以上我做的是一步克隆，都没有连上···...

你的不是加A了吗？   这样是可以的。就是TA克隆嘛
片段加3ul
赞一下(1人) 回复此楼
24楼2014-07-26 14:39:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小冀-: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-27 12:08:48
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 09:29:18
DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u...

你的目的基因这么大，DNA量加的不够。连接体系里的DNA分子数大概是载体量的3-5倍。你的片段和载体差不多一样大，那么你加入的DNA重量至少要是载体的三倍。建议你做个梯度，3:1，4:1，5:1这样。因为目的片段基本上和载体差不多大甚至比载体更大，连接会比较困难。
赞一下(1人) 回复此楼
下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
26楼2014-07-26 17:30:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

风灵之翼

金虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-29 16:06:17
给你个可以连接的方法，按照标准体系配置完成后，将反应体系放在4度冰箱的门上，门上温度大约在10度左右，连接过夜或者24小时，成功几率很大

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下(1人) 回复此楼
28楼2014-07-28 16:52:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接效率太低，PCR产物要纯化
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-25 11:33:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用Taq DNA聚合酶进行PCR之后进行相应的酶切就直接连接载体了吗？
赞一下 回复此楼
坚持到底就是胜利！
4楼2014-07-25 11:38:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panhp2004

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 13:58:12
构建质粒的一般步骤：
扩增目的基因---PCR产物纯化，加17ul 洗脱液洗脱（PCR产物纯化试剂盒做）---双酶切，30或50ul 体系，纯化后的PCR产物取 10ul，载体取 3ul，37度 约3-4h---胶回收（胶回收试剂盒做），加17ul 洗脱液洗脱----连接，16度，约3-4h----转化，热激时，42度，40 s 即可----后培养，加200 ul  液体LB ，37度静止培养 1 h----取200 ul 涂氨苄。
赞一下 回复此楼
追梦是一个快乐的过程。
5楼2014-07-25 13:11:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-25 10:20:16
我觉得第一次做的比较好，因为第二次你没有纯化。
个人觉得是你连接体系出问题了，你可以把具体信息写下来给你看看。
热击90s后，要记得冰上5min，然后加SOC,再37度恢复培养。

纯化是什么意思？载体和目的片段都是跑胶回收的···热击后，我冰浴了2min，然后才活化的···
赞一下 回复此楼
···
6楼2014-07-25 13:13:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-25 11:33:56
连接效率太低，PCR产物要纯化

载体和目的片段都是跑胶回收过的，应该算是纯化了吧···
赞一下 回复此楼
···
7楼2014-07-25 13:14:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
5楼: Originally posted by panhp2004 at 2014-07-25 13:11:27
构建质粒的一般步骤：
扩增目的基因---PCR产物纯化，加17ul 洗脱液洗脱（PCR产物纯化试剂盒做）---双酶切，30或50ul 体系，纯化后的PCR产物取 10ul，载体取 3ul，37度 约3-4h---胶回收（胶回收试剂盒做），加17ul  ...

步骤我都知道的···
赞一下 回复此楼
···
9楼2014-07-25 13:17:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小冀- 的主题更新
351/4返回列表1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿A区211，22408 321求调剂 +7 随心所欲☆ 2026-04-15 8/400 2026-04-21 08:22 by Equinoxhua
[基金申请] 河北省自然基金 +3 Peterchao 2026-04-14 3/150 2026-04-21 08:17 by kudofaye
[考研] 一志愿中科大材料与化工，353分还有调剂学校吗 +11 否极泰来2026 2026-04-15 13/650 2026-04-20 22:31 by Equinoxhua
[考研] 320求调剂 +6 深郊akm 2026-04-17 6/300 2026-04-20 18:57 by fs26jie
[论文投稿] 期刊推荐 +3 材料研究生 2026-04-15 5/250 2026-04-20 16:02 by 豆豆7758
[论文投稿] 有没有接收比较快的sci期刊呀，最好在一个月之内的，研三孩子求毕业 20+4 之护着 2026-04-16 7/350 2026-04-20 15:45 by 豆豆7758
[教师之家] 又一批高校组建人工智能学院 师资行吗 不是骗人吗 +4 yexuqing 2026-04-19 4/200 2026-04-20 14:47 by brantleo
[考博] 湖南大学刘巧玲课题组2026年第二批次博士研究生招生信息 +3 南风观火 2026-04-18 5/250 2026-04-20 10:13 by 南风观火
[考研] 291求调剂 +11 关忆北. 2026-04-14 11/550 2026-04-19 17:16 by 中豫男
[考研] 304求调剂 +8 castLight 2026-04-16 8/400 2026-04-19 17:14 by 中豫男
[考研] 求调剂 +10 小聂爱学习 2026-04-16 12/600 2026-04-19 16:51 by 中豫男
[考研] 291求调剂 +12 关忆北. 2026-04-14 13/650 2026-04-19 16:50 by 中豫男
[考研] 085404 22408 309分求调剂 +10 lzmk 2026-04-14 11/550 2026-04-19 16:42 by 中豫男
[考研] 求调剂 +6 苦命人。。。 2026-04-18 7/350 2026-04-19 16:27 by 中豫男
[考研] 307中医考研调剂 +9 于以采蘩 2026-04-14 9/450 2026-04-19 08:41 by 烟雨流涯
[考研] 297，工科调剂? +5 河南农业大学-能 2026-04-14 5/250 2026-04-18 15:17 by Equinoxhua
[考研] 260求调剂 +4 Zyt1314520.. 2026-04-17 5/250 2026-04-18 08:28 by babysonlkd
[考研] 一志愿华中农业071010，320求调剂 +17 困困困困坤坤 2026-04-14 19/950 2026-04-17 20:08 by 关一盏灯cd
[考研] 一志愿沪9，生物学326求调剂 +9 刘墨墨 2026-04-15 9/450 2026-04-16 17:14 by 崔崔崔cccc
[考研] 药学求调剂 +14 喽哈加油 2026-04-14 16/800 2026-04-16 10:15 by beilsong20
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭