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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pMD-19T载体与目的片段的连接问题
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

[求助] pMD-19T载体与目的片段的连接问题 已有6人参与

之前计划目的基因（3.6Kb）与pMD-19T进行TA克隆连接，目的片段用primerstar高保真酶后加A连接，氨苄板生长，鉴定后发现是载体自连；后来用Taq酶PCR扩增后直接与pMD-19T载体链接，最后发现还是自连的···发现这都不行后就进行一步克隆（ClonExpressTM快速克隆技术），之前认为在载体是线性的，就直接连了，但是没有连上，氨苄平板上没长；后来用以前构建好的质粒进行双酶切后进行一步克隆，可是氨苄平板上还是没有长···各位大神，求助···
转化条件：
感受态是自己用氯化钙法做的，以前也是用它来做转化，都可以的···
热击90s后，37℃活化1h后，将转化液浓缩全部涂平板···
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···
1楼 2014-07-25 09:35:38
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用Taq DNA聚合酶进行PCR之后进行相应的酶切就直接连接载体了吗？
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坚持到底就是胜利！
4楼2014-07-25 11:38:57
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 10:54:32
我觉得第一次做的比较好，因为第二次你没有纯化。
个人觉得是你连接体系出问题了，你可以把具体信息写下来给你看看。
热击90s后，要记得冰上5min，然后加SOC,再37度恢复培养。
赞一下 回复此楼
2楼2014-07-25 10:20:16
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接效率太低，PCR产物要纯化
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3楼2014-07-25 11:33:56
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panhp2004

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 13:58:12
构建质粒的一般步骤：
扩增目的基因---PCR产物纯化，加17ul 洗脱液洗脱（PCR产物纯化试剂盒做）---双酶切，30或50ul 体系，纯化后的PCR产物取 10ul，载体取 3ul，37度 约3-4h---胶回收（胶回收试剂盒做），加17ul 洗脱液洗脱----连接，16度，约3-4h----转化，热激时，42度，40 s 即可----后培养，加200 ul  液体LB ，37度静止培养 1 h----取200 ul 涂氨苄。
赞一下 回复此楼
追梦是一个快乐的过程。
5楼2014-07-25 13:11:27
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