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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pMD-19T载体与目的片段的连接问题
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 09:29:18
DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u...

或者16度过夜。    如果有电转的DH5a或者XL1-Blue感受态，就用电转化做，没有的话就热击。
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21楼2014-07-26 10:43:44
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小冀-

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19楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-26 10:34:06
你的DNA片段是多少bp？...

3690
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···
22楼2014-07-26 12:38:07
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小冀-

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20楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-26 10:42:10
按这个体系做下：
PMD-19T:  5ul  【0.03pmol】
DNA：   99*DNA大小/（1000*140）ul  【0.15pmol】
5Xbuffer:   2ul
enzyme:   1ul
补水到10ul。
16度连接8-10h，做转化。...

这是普通的酶切链接吧，我也在考虑做三个浓度梯度进行连接，以上我做的是一步克隆，都没有连上···
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···
23楼2014-07-26 12:39:37
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 12:39:37
这是普通的酶切链接吧，我也在考虑做三个浓度梯度进行连接，以上我做的是一步克隆，都没有连上···...

你的不是加A了吗？   这样是可以的。就是TA克隆嘛
片段加3ul
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24楼2014-07-26 14:39:47
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小冀-

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引用回帖:
24楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-26 14:39:47
你的不是加A了吗？   这样是可以的。就是TA克隆嘛
片段加3ul...

那是以前的，可是没有做出来···不过还是谢谢了···
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25楼2014-07-26 14:57:17
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小冀-: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-27 12:08:48
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 09:29:18
DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u...

你的目的基因这么大，DNA量加的不够。连接体系里的DNA分子数大概是载体量的3-5倍。你的片段和载体差不多一样大，那么你加入的DNA重量至少要是载体的三倍。建议你做个梯度，3:1，4:1，5:1这样。因为目的片段基本上和载体差不多大甚至比载体更大，连接会比较困难。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
26楼2014-07-26 17:30:40
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 14:57:17
那是以前的，可是没有做出来···不过还是谢谢了···...

试着再这样做一次  说不准是操作火鹤其他方面的愿意   祝你成功
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27楼2014-07-27 09:34:51
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风灵之翼

金虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-29 16:06:17
给你个可以连接的方法，按照标准体系配置完成后，将反应体系放在4度冰箱的门上，门上温度大约在10度左右，连接过夜或者24小时，成功几率很大

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28楼2014-07-28 16:52:28
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风灵之翼

金虫 (初入文坛)
给你个可以连接的方法，按照标准体系配置完成后，将反应体系放在4度冰箱的门上，门上温度大约在10度左右，连接过夜或者24小时，成功几率很大

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小冀-
29楼2014-07-28 17:42:41
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小冀-

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送红花一朵
引用回帖:
29楼: Originally posted by 风灵之翼 at 2014-07-28 17:42:41
给你个可以连接的方法，按照标准体系配置完成后，将反应体系放在4度冰箱的门上，门上温度大约在10度左右，连接过夜或者24小时，成功几率很大

可以一试···
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···
30楼2014-07-28 17:57:41
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