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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pMD-19T载体与目的片段的连接问题
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-25 13:13:11
纯化是什么意思？载体和目的片段都是跑胶回收的···热击后，我冰浴了2min，然后才活化的···...

纯化就是跑胶回收，现在看来最大可能是连接这里有点小问题了吧。
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11楼2014-07-25 15:04:06
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
把连接体系写上来，以及片段载体多大，浓度多大。
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12楼2014-07-25 15:05:20
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 21:58:19
小冀-: 金币+1, ★有帮助 2014-07-26 09:24:40
这个载体应该是可以做蓝白斑筛选的吧，做个蓝白斑很容易就能看出来有没有插入基因。一般白斑的插入率应该有90%，你的目的片段略大，可能会稍微低一些。确认一下这个大小是否超过了载体的上限。

不知道你的连接体系是怎样的，你的片段跟载体的大小基本差不多，所以要多加目的片段进行连接，用3：1甚至5：1的比例，加大目的片段的插入效率。没用过这个载体，也确认一下这个载体是不是能直接用来TA克隆。

至于你后来说的双酶切后进一步克隆，体系是怎样的？你的目的基因有相应的酶切位点么？
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
13楼2014-07-25 21:29:31
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sj082csh

银虫 (小有名气)
★
小冀-(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:01:44
你好，可能是你的目的片段太长了。。 建议您换一下连接体系。 PMD19-T中，T4连接酶在solution I 里，好像本身连接效率就不高，况且你的片段3.6K
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14楼2014-07-25 23:21:31
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gaoyu_8848

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小冀-: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-07-26 09:30:56
原因是片段太长， 3.6K要连上去很难，因为载体也差不多是这么大。考虑把3.6k扩3个小1k左右的小片段，分步连上去。需要找到重合处的唯一内切酶位点。
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15楼2014-07-26 00:15:41
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
15楼: Originally posted by gaoyu_8848 at 2014-07-26 00:15:41
原因是片段太长， 3.6K要连上去很难，因为载体也差不多是这么大。考虑把3.6k扩3个小1k左右的小片段，分步连上去。需要找到重合处的唯一内切酶位点。

这样的话，如果3个小片段有任何一个出现问题，那我的蛋白不就表达不了了吗？？？
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···
16楼2014-07-26 09:22:22
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
13楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-25 21:29:31
这个载体应该是可以做蓝白斑筛选的吧，做个蓝白斑很容易就能看出来有没有插入基因。一般白斑的插入率应该有90%，你的目的片段略大，可能会稍微低一些。确认一下这个大小是否超过了载体的上限。

不知道你的连接体 ...

一步克隆时只是在双切基础上加了一段同源臂，目的基因里没有双切用到的两种酶，都是设计引物的时候加上去的···
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···
17楼2014-07-26 09:24:28
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
12楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-25 15:05:20
把连接体系写上来，以及片段载体多大，浓度多大。

DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u
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···
18楼2014-07-26 09:29:18
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 09:29:18
DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u...

你的DNA片段是多少bp？
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19楼2014-07-26 10:34:06
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
小冀-(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:02:12
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 09:29:18
DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u...

按这个体系做下：
PMD-19T:  5ul  【0.03pmol】
DNA：   99*DNA大小/（1000*140）ul  【0.15pmol】
5Xbuffer:   2ul
enzyme:   1ul
补水到10ul。
16度连接8-10h，做转化。
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20楼2014-07-26 10:42:10
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