【答案】应助回帖

11楼2014-07-25 15:04:06

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

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把连接体系写上来，以及片段载体多大，浓度多大。

12楼2014-07-25 15:05:20

usky_4

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 21:58:19
小冀-: 金币+1, ★有帮助 2014-07-26 09:24:40

这个载体应该是可以做蓝白斑筛选的吧，做个蓝白斑很容易就能看出来有没有插入基因。一般白斑的插入率应该有90%，你的目的片段略大，可能会稍微低一些。确认一下这个大小是否超过了载体的上限。

不知道你的连接体系是怎样的，你的片段跟载体的大小基本差不多，所以要多加目的片段进行连接，用3：1甚至5：1的比例，加大目的片段的插入效率。没用过这个载体，也确认一下这个载体是不是能直接用来TA克隆。

至于你后来说的双酶切后进一步克隆，体系是怎样的？你的目的基因有相应的酶切位点么？

下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧

13楼2014-07-25 21:29:31

sj082csh

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★
小冀-(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:01:44

你好，可能是你的目的片段太长了。。建议您换一下连接体系。 PMD19-T中，T4连接酶在solution I 里，好像本身连接效率就不高，况且你的片段3.6K

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14楼2014-07-25 23:21:31

gaoyu_8848

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小冀-: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-07-26 09:30:56

原因是片段太长， 3.6K要连上去很难，因为载体也差不多是这么大。考虑把3.6k扩3个小1k左右的小片段，分步连上去。需要找到重合处的唯一内切酶位点。

15楼2014-07-26 00:15:41

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引用回帖:

15楼: Originally posted by gaoyu_8848 at 2014-07-26 00:15:41
原因是片段太长， 3.6K要连上去很难，因为载体也差不多是这么大。考虑把3.6k扩3个小1k左右的小片段，分步连上去。需要找到重合处的唯一内切酶位点。

这样的话，如果3个小片段有任何一个出现问题，那我的蛋白不就表达不了了吗？？？

···

16楼2014-07-26 09:22:22

小冀-

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13楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-25 21:29:31
这个载体应该是可以做蓝白斑筛选的吧，做个蓝白斑很容易就能看出来有没有插入基因。一般白斑的插入率应该有90%，你的目的片段略大，可能会稍微低一些。确认一下这个大小是否超过了载体的上限。

不知道你的连接体 ...

一步克隆时只是在双切基础上加了一段同源臂，目的基因里没有双切用到的两种酶，都是设计引物的时候加上去的···

···

17楼2014-07-26 09:24:28