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小冀-

版主 (著名写手)

应助: 713 (博后)
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专业: 生物信息学
管辖: 微生物

[求助] pMD-19T载体与目的片段的连接问题已有6人参与

之前计划目的基因（3.6Kb）与pMD-19T进行TA克隆连接，目的片段用primerstar高保真酶后加A连接，氨苄板生长，鉴定后发现是载体自连；后来用Taq酶PCR扩增后直接与pMD-19T载体链接，最后发现还是自连的···发现这都不行后就进行一步克隆（ClonExpressTM快速克隆技术），之前认为在载体是线性的，就直接连了，但是没有连上，氨苄平板上没长；后来用以前构建好的质粒进行双酶切后进行一步克隆，可是氨苄平板上还是没有长···各位大神，求助···
转化条件：
感受态是自己用氯化钙法做的，以前也是用它来做转化，都可以的···
热击90s后，37℃活化1h后，将转化液浓缩全部涂平板···

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···

1楼 2014-07-25 09:35:38

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usky_4

银虫 (小有名气)

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性别: GG
专业: 造血干细胞移植

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 21:58:19
小冀-: 金币+1, ★有帮助 2014-07-26 09:24:40

这个载体应该是可以做蓝白斑筛选的吧，做个蓝白斑很容易就能看出来有没有插入基因。一般白斑的插入率应该有90%，你的目的片段略大，可能会稍微低一些。确认一下这个大小是否超过了载体的上限。

不知道你的连接体系是怎样的，你的片段跟载体的大小基本差不多，所以要多加目的片段进行连接，用3：1甚至5：1的比例，加大目的片段的插入效率。没用过这个载体，也确认一下这个载体是不是能直接用来TA克隆。

至于你后来说的双酶切后进一步克隆，体系是怎样的？你的目的基因有相应的酶切位点么？