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chenchenand新虫 (小有名气)
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急求！大容量载体与片段连接问题 已有2人参与
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现手上有一质粒，大小为10kb，红霉素抗性。没有全序列，只有其编码的一个基因的序列，大小约为1.5kb。测序发现，该基因的一个碱基发生了点突变，导致编码蛋白的活性很低。为了解决这个问题，我通过HindIII和KpnI两个酶将这段序列切下来，连接到puc 19这个载体上。后通过点突变试剂盒完成了该碱基的突变。后再通过上述两个酶把该基因的片段连回上述大质粒，连接转化了有2个月，长的菌都是假阳性（大肠杆菌对红霉素有一定的耐受性）。酶切后的载体经纯化后浓度为30ng/微升，1.5kb的片段纯化后浓度为40ng/微升，连接体系10微升，20微升都试过了，各种比例（载体：片段=1:3-6）都试过了，采用电转方式，感受态是dh5a，都没有阳性克隆长出。咨询了一些人，有些人认为大载体连接，我这个浓度太低了，要切胶纯化后达到几百ng/微升才行；有些人建议连接体系放大些，比如50微升，连接后再用乙醇浓缩等等。这些都准备试一下，还请大家针对我这个问题，提提建议， ，谢谢！ |
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-18 10:30:09
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看了你的情况有以下几点看法 1.你转化后的假阳性是含有空载质粒的转化子还是菌里面啥质粒都没有就能长出来。如果是前者那很有可能你对载体的酶切不完全，那在酶切上下工夫，比如延长切割时间或者分步酶切。如果是后者的话，那你得做个红霉素浓度梯度的实验，设置不同抗生素浓度的平板，一批平板涂含质粒的菌，一批涂不含质粒的菌，最好的结果是一定浓度的抗生素能完全抑制野生菌而又不影响带质粒菌转化子的出现。抗生素的筛选效果很重要，如果抗生素效果不行那你后期的转化后筛选会非常困难。 2.你载体明显不够，一般连接载体添加量得有0.02pmol，大约相当于4kb的质粒50ng，基因大于等于0.06pmol，大约相当于1kb的基因37.5ng以上，你的质粒那么大那单位质量的摩尔数肯定小，你的质粒和基因的浓度都不高，整个体系中你还要顾及基因和载体的比例因此你的载体肯定没有加够，抗生素筛选效果再不好的话，自然很多的假阳性 3.你那个基因和载体的比例是质量比吗？如果是质量比的话那你的基因和载体的摩尔比远高于10:1，你说的那个1:3——1:6是指的摩尔比，单纯的质量比没有任何意义。一般来说基因和载体的摩尔比在3:1到10:1之间，过高的比例不利于正确的连接。 4.因为你的载体还是很大的，酶连可能确实不好连，但是handIII的粘性末端连接效率很高，因此酶连最好分两步走，首先用小体系（10ul）16度过夜酶连或者酶连20h，之后加水稀释补加T4酶和buffer到20ul—50ul进行二次酶连，酶连完不需要浓缩取适当体积进行转化即可。 |
2楼2014-07-18 05:45:09
chenchenand
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