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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两个基因片段的连接问题？
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xiaoxia110

木虫 (正式写手)

[求助] 两个基因片段的连接问题？ 已有1人参与

1 我要将两个基因片段A,B克隆到pcDNA载体上，请问我将这两个基因片段分别扩增，并使它们有一个酶切位点相同，然后分别酶切，再用T4连接酶将它们连接，形成A-B,这样是否可行？


2  如果可行的话，是不是将A,B,载体同时双酶切，然后混在一起，用T4连接酶连接，是否能得到所需要的重组载体？
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1楼 2013-05-09 14:33:53
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒

你看一下吧.不需要酶切位点.
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2楼2013-05-09 17:16:59
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zhangzhilai

金虫 (正式写手)
★
xiaoxia110(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-10 13:12:03
可以将A、B两端基因做个重叠延伸形成完整片段，再酶连
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3楼2013-05-09 21:12:32
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiaoxia110(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-10 13:11:56
可行的, 这类三段连接的实验我做过, 和楼主提到过程一样的一样. 用前面回复你的虫友的方法也可以, 只是你需要额外订引物.
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4楼2013-05-09 21:51:09
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xiaoxia110

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-09 21:51:09
可行的, 这类三段连接的实验我做过, 和楼主提到过程一样的一样. 用前面回复你的虫友的方法也可以, 只是你需要额外订引物.

这样行的？引物不是两端都是羟基？扩增出来之后还是羟基，A和B两个扩增片段都是羟基，用T4连接酶可以连接吗？
你的引物没有进行磷酸化处理？就直接双酶切后混在一起？
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5楼2013-05-12 21:19:14
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
你不是用酶切过了么，引物末端早切掉了。
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6楼2013-05-12 21:34:42
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peng5053

银虫 (正式写手)

Dr.
你这样做是可以的。不过需要考虑的是克隆效率的问题。建议你酶切后胶回收。在选择酶切位点的时候要多考虑下。可以考虑使用同尾酶。
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多点思维，多点idea
7楼2013-05-12 21:41:45
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

最简单的方法，先设计Overlap PCR，把AB基因先融合起来，然后再装到目标载体上
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-05-12 22:48:38
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-05-12 22:48:38
最简单的方法，先设计Overlap PCR，把AB基因先融合起来，然后再装到目标载体上

我看很多用这个方法设计连接肽进来，不知直接将二基因融合有无相关经典文献或者说是操作步骤
谢谢！
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9楼2013-05-12 23:42:33
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liyu0355 at 2013-05-09 17:16:59
NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒

你看一下吧.不需要酶切位点.

与CloneEZ重组克隆试剂盒
相比效果效率哪个更好？
最近正在比较，看哪个更好用
周期怎样》
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10楼2013-05-12 23:51:26
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