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xiaoxia110

木虫 (正式写手)

[求助] 两个基因片段的连接问题? 已有1人参与

1 我要将两个基因片段A,B克隆到pcDNA载体上,请问我将这两个基因片段分别扩增,并使它们有一个酶切位点相同,然后分别酶切,再用T4连接酶将它们连接,形成A-B,这样是否可行?


2  如果可行的话,是不是将A,B,载体同时双酶切,然后混在一起,用T4连接酶连接,是否能得到所需要的重组载体?
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒

你看一下吧.不需要酶切位点.
2楼2013-05-09 17:16:59
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zhangzhilai

金虫 (正式写手)


xiaoxia110(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-10 13:12:03
可以将A、B两端基因做个重叠延伸形成完整片段,再酶连
3楼2013-05-09 21:12:32
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xiaoxia110(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流经验! 2013-05-10 13:11:56
可行的, 这类三段连接的实验我做过, 和楼主提到过程一样的一样. 用前面回复你的虫友的方法也可以, 只是你需要额外订引物.
4楼2013-05-09 21:51:09
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xiaoxia110

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-09 21:51:09
可行的, 这类三段连接的实验我做过, 和楼主提到过程一样的一样. 用前面回复你的虫友的方法也可以, 只是你需要额外订引物.

这样行的?引物不是两端都是羟基?扩增出来之后还是羟基,A和B两个扩增片段都是羟基,用T4连接酶可以连接吗?
你的引物没有进行磷酸化处理?就直接双酶切后混在一起?
5楼2013-05-12 21:19:14
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

你不是用酶切过了么,引物末端早切掉了。
6楼2013-05-12 21:34:42
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peng5053

银虫 (正式写手)

Dr.

你这样做是可以的。不过需要考虑的是克隆效率的问题。建议你酶切后胶回收。在选择酶切位点的时候要多考虑下。可以考虑使用同尾酶。
多点思维,多点idea
7楼2013-05-12 21:41:45
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

最简单的方法,先设计Overlap PCR,把AB基因先融合起来,然后再装到目标载体上
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-05-12 22:48:38
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-05-12 22:48:38
最简单的方法,先设计Overlap PCR,把AB基因先融合起来,然后再装到目标载体上

我看很多用这个方法设计连接肽进来,不知直接将二基因融合有无相关经典文献或者说是操作步骤
谢谢!
9楼2013-05-12 23:42:33
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by liyu0355 at 2013-05-09 17:16:59
NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒

你看一下吧.不需要酶切位点.

与CloneEZ重组克隆试剂盒
相比效果效率哪个更好?
最近正在比较,看哪个更好用
周期怎样》
10楼2013-05-12 23:51:26
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