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车阳

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体与片段连不上

我的目的片段大概2500bp,连接T载体成功,然后用BamHI与kpnI双酶切连在表达载体PKC1139上,就是这一步一直连不上。连T载体的没有问题,T载体双酶切完全,载体由于酶切位点很近,不知道切完全没。分别尝试用T4和 solutionI16℃连接过夜,只加载体片段作为阴性对照,转化大肠杆菌就是转不出来,对照也没有,不知道为什么,求助
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lm2570

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-16 18:17:20
车阳: 金币+1, 有帮助 2013-12-17 13:52:50
这是常有的事,可以尝试延长连接时间。T4  DNA连接酶也可能失活,逐一试吧
2楼2013-12-16 09:56:06
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tilling

新虫 (初入文坛)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-16 18:17:28
买个无缝连接的盒子,很快就能搞定的。快多了,效率也高!
3楼2013-12-16 13:39:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
车阳: 金币+1, 有帮助 2013-12-17 13:53:24
感受态没问题吧,做转化时最好同时有正负对照。
4楼2013-12-17 13:15:28
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车阳

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-17 13:15:28
感受态没问题吧,做转化时最好同时有正负对照。

没问题,昨天做了对照,拿原来做过的质粒做了转化,没问题
5楼2013-12-17 13:41:28
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车阳

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lm2570 at 2013-12-16 09:56:06
这是常有的事,可以尝试延长连接时间。T4  DNA连接酶也可能失活,逐一试吧

好,我再试试~连接我现在做到19个小时,再长会不会有影响,比如降解
6楼2013-12-17 13:43:18
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验! 2014-01-29 16:08:26
我现在也是连接不上啊  各种问题  你应该加一个感受态测定效率的对照 如果感受态效率够 至少载体应该完全切开了  还有可能就是载体和外源比例不对  建议胶回收的载体和外源不要用分光光度计定量 最好跑个胶看看
7楼2013-12-17 13:58:31
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车阳

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by tilling at 2013-12-16 13:39:18
买个无缝连接的盒子,很快就能搞定的。快多了,效率也高!

实验室条件有限,而且我之前连接平末端都连上去了,不知道这次又是什么问题,不过还是谢谢你~
8楼2013-12-17 14:00:30
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车阳

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zhuzhicheng at 2013-12-17 13:58:31
我现在也是连接不上啊  各种问题  你应该加一个感受态测定效率的对照 如果感受态效率够 至少载体应该完全切开了  还有可能就是载体和外源比例不对  建议胶回收的载体和外源不要用分光光度计定量 最好跑个胶看看

感受态昨天做了对照,加了两微升原来做过的质粒进行转化,一个板都是,应该效率不低。载体与片段都是切胶回收,跑过胶,测过浓度,连接体系根据TAKARA T4 DNA ligase 的说明书严格计算加的,载体0.03pmol,片段0.3pmol,总体系25微升,片段双酶切彻底,载体不能确定,我现在想知道还有哪些细节我可能没有注意到的,导致我连不上去。
9楼2013-12-17 14:06:19
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周志惠

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
车阳: 金币+3, 有帮助 2013-12-26 13:17:30
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2014-01-29 16:08:39
载体是双酶切还是交叉酶切的呢?两个酶切问点离得近,采用交叉酶切比较好
10楼2013-12-18 08:51:54
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