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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T载体的阴性对照菌落比实验组多
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mengbiotech

金虫 (小有名气)

[求助] T载体的阴性对照菌落比实验组多

最近在做PCR产物连接，产物长度10 kb，切胶回收；
分别用pMD18T和pGEMT载体连接，有实验组，阳性对照和阴性对照；
载体与片段的摩尔比为1:5；连接前将片段在60℃水浴10 min消除高级结构；
转化过夜后发现：
阳性对照平板基本长满，阴性对照比实验组长的菌落多。
按理说即使连不上的话，阴性对照和实验组不也应该是一样多的吗？
自己考虑可能的原因是实验组的PCR产物是溶解在elution buffer中，而阴性对照组加的是ddH2O，buffer中的各种离子可能影响了连接效率。
请问还有别的可能的原因吗？
此外，大家有没有推荐的方法连接10 kb这么大的片段啊？
不胜感激。。
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热爱生活，热爱生命
1楼 2013-06-26 08:59:17
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-26 12:31:22
T 载体可以蓝白斑筛选，很容易确认。10kb可以直接在引物加内切酶和保护碱基，直接切PCR 产物
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
2楼2013-06-26 09:18:43
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mengbiotech

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dcb005 at 2013-06-26 09:18:43
T 载体可以蓝白斑筛选，很容易确认。10kb可以直接在引物加内切酶和保护碱基，直接切PCR 产物

请问T载体连10 kb的难度大吗？
现在的主要问题是我无法解释为什么阴性对照比实验组长出的菌落多。
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热爱生活，热爱生命
3楼2013-06-26 09:38:46
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by mengbiotech at 2013-06-26 09:38:46
请问T载体连10 kb的难度大吗？
现在的主要问题是我无法解释为什么阴性对照比实验组长出的菌落多。...

我没连接过这么大的，片段比载体大很多，连接起来应该比段难度大很多
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
4楼2013-06-26 16:24:45
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