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mengbiotech金虫 (小有名气)
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[求助]
T载体的阴性对照菌落比实验组多
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最近在做PCR产物连接，产物长度10 kb，切胶回收； 分别用pMD18T和pGEMT载体连接，有实验组，阳性对照和阴性对照； 载体与片段的摩尔比为1:5；连接前将片段在60℃水浴10 min消除高级结构； 转化过夜后发现： 阳性对照平板基本长满，阴性对照比实验组长的菌落多。 按理说即使连不上的话，阴性对照和实验组不也应该是一样多的吗？ 自己考虑可能的原因是实验组的PCR产物是溶解在elution buffer中，而阴性对照组加的是ddH2O，buffer中的各种离子可能影响了连接效率。 请问还有别的可能的原因吗？ 此外，大家有没有推荐的方法连接10 kb这么大的片段啊？ 不胜感激。。 |
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