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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体与片段连不上
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车阳

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体与片段连不上

我的目的片段大概2500bp，连接T载体成功，然后用BamHI与kpnI双酶切连在表达载体PKC1139上，就是这一步一直连不上。连T载体的没有问题，T载体双酶切完全，载体由于酶切位点很近，不知道切完全没。分别尝试用T4和 solutionI16℃连接过夜，只加载体片段作为阴性对照，转化大肠杆菌就是转不出来，对照也没有，不知道为什么，求助
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1楼 2013-12-16 09:03:07
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lm2570

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-16 18:17:20
车阳: 金币+1, ★有帮助 2013-12-17 13:52:50
这是常有的事，可以尝试延长连接时间。T4  DNA连接酶也可能失活，逐一试吧
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2楼2013-12-16 09:56:06
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tilling

新虫 (初入文坛)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-16 18:17:28
买个无缝连接的盒子，很快就能搞定的。快多了，效率也高！
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3楼2013-12-16 13:39:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
车阳: 金币+1, ★有帮助 2013-12-17 13:53:24
感受态没问题吧，做转化时最好同时有正负对照。
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4楼2013-12-17 13:15:28
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车阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-17 13:15:28
感受态没问题吧，做转化时最好同时有正负对照。

没问题，昨天做了对照，拿原来做过的质粒做了转化，没问题
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5楼2013-12-17 13:41:28
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车阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lm2570 at 2013-12-16 09:56:06
这是常有的事，可以尝试延长连接时间。T4  DNA连接酶也可能失活，逐一试吧

好，我再试试~连接我现在做到19个小时，再长会不会有影响，比如降解
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6楼2013-12-17 13:43:18
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-01-29 16:08:26
我现在也是连接不上啊  各种问题  你应该加一个感受态测定效率的对照 如果感受态效率够 至少载体应该完全切开了  还有可能就是载体和外源比例不对  建议胶回收的载体和外源不要用分光光度计定量 最好跑个胶看看
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7楼2013-12-17 13:58:31
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车阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tilling at 2013-12-16 13:39:18
买个无缝连接的盒子，很快就能搞定的。快多了，效率也高！

实验室条件有限，而且我之前连接平末端都连上去了，不知道这次又是什么问题，不过还是谢谢你~
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8楼2013-12-17 14:00:30
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车阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhuzhicheng at 2013-12-17 13:58:31
我现在也是连接不上啊  各种问题  你应该加一个感受态测定效率的对照 如果感受态效率够 至少载体应该完全切开了  还有可能就是载体和外源比例不对  建议胶回收的载体和外源不要用分光光度计定量 最好跑个胶看看

感受态昨天做了对照，加了两微升原来做过的质粒进行转化，一个板都是，应该效率不低。载体与片段都是切胶回收，跑过胶，测过浓度，连接体系根据TAKARA T4 DNA ligase 的说明书严格计算加的，载体0.03pmol，片段0.3pmol,总体系25微升，片段双酶切彻底，载体不能确定，我现在想知道还有哪些细节我可能没有注意到的，导致我连不上去。
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9楼2013-12-17 14:06:19
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周志惠

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
车阳: 金币+3, ★有帮助 2013-12-26 13:17:30
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:08:39
载体是双酶切还是交叉酶切的呢？两个酶切问点离得近，采用交叉酶切比较好
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10楼2013-12-18 08:51:54
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