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Yocan2012

新虫 (小有名气)

[求助] 片段与载体的连接问题

本人自己构建了一个8863bp大小的载体，想要将1900bp大小的目的基因连接到该载体上，使用的内切酶是SmaI/NotI。一开始很容易就连上了，1个月后再进行连接的时候，却在也连不上了。酶切没有问题；连接酶用的是Takara公司的Solution I，应该也没有问题，因为用它连接T载体的效率比较高。
用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性；如果用PCR产物直接酶切后连接的话，在选择性平板上没有菌落生长。
求高人或者有过同样遭遇的虫友指点。
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1楼 2013-01-18 17:40:52
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
"用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性"
不明白这是什么意思。你把片段从T载体切下来后不回收片段的吗？为什么还会有连到T载体上的假阳性？
PCR产物做酶切连接没有的话可能是PCR产物酶切不完全。NotI需要6个保护碱基切过夜。
还有，不知道你开始既然很容易连上了，为什么1个月后还要再连呢？
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2楼2013-01-19 08:32:58
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Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-19 08:32:58
"用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性"
不明白这是什么意思。你把片段从T载体切下来后不回收片段的吗？为什么还会有连到T载体上的假阳性？
PCR产物做酶切连接没有的话可 ...

是从T载体上面切下来的，完全分开后做胶回收，而且回收后的条带很单一。
酶切不完全有可能，但是8个平板一个菌落都不长就不至于了吧？
和一个月前连接的是相同大小的不同基因，而且用的酶切位点是一样的。
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3楼2013-01-19 11:10:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-19 11:10:35
是从T载体上面切下来的，完全分开后做胶回收，而且回收后的条带很单一。
酶切不完全有可能，但是8个平板一个菌落都不长就不至于了吧？
和一个月前连接的是相同大小的不同基因，而且用的酶切位点是一样的。...

既然你的目的片段是从T载体切下来胶回收的，应该是没什么问题。连接的时候是否做了只有载体不加目的片段的对照？如果这个对照上长很多克隆，说明载体酶切不好。可以从新酶切载体。什么的都不长虽然是理论上的结果，但一般情况下酶切不可能100%，还是会有少许克隆的。如果真的什么都不长，可能是连接酶有问题或者转化失败。
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4楼2013-01-19 12:12:31
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loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以用第一个基因连接载体的质粒进行酶切，回收后与第二个基因连接。
也可以尝试用T4连接酶代替Solution1进行连接。
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5楼2013-01-19 13:19:50
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Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by loveerobin at 2013-01-19 13:19:50
可以用第一个基因连接载体的质粒进行酶切，回收后与第二个基因连接。
也可以尝试用T4连接酶代替Solution1进行连接。

是的，用的就是连接有第一个基因的载体，所以才说酶切没有问题的，因为可以明确看到是切开的。
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6楼2013-01-19 15:24:26
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loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-19 15:24:26
是的，用的就是连接有第一个基因的载体，所以才说酶切没有问题的，因为可以明确看到是切开的。...

酶切回收产物跑电泳检测了吗？
那就再做一次转化吧
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7楼2013-01-19 16:22:57
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Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by loveerobin at 2013-01-19 16:22:57
酶切回收产物跑电泳检测了吗？
那就再做一次转化吧...

载体和片段回收后的电泳条带都很亮很单一。
已经做了无数次了，发现每个环节似乎都没有问题，但就是不出结果。
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8楼2013-01-19 22:56:43
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loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-19 22:56:43
载体和片段回收后的电泳条带都很亮很单一。
已经做了无数次了，发现每个环节似乎都没有问题，但就是不出结果。...

那就是感受态和板子的问题了
借别人的感受态用用
如果一样的话，大概是自己的板子时间太久了或者抗生素需要重新配制了
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9楼2013-01-20 12:17:05
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Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by loveerobin at 2013-01-20 12:17:05
那就是感受态和板子的问题了
借别人的感受态用用
如果一样的话，大概是自己的板子时间太久了或者抗生素需要重新配制了...

我想问，你们做连接用的质粒都是当天提取、酶切、回收、连接的么？我有时候会用放了一段时间的质粒来做连接。
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10楼2013-01-20 16:45:59
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