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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 目的片段和载体连接一直不上
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段和载体连接一直不上 已有7人参与

1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。
2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。
感谢您的帮助。
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在学术的汪洋里，扑腾。
1楼 2014-04-12 20:46:55
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-04-14 17:07:31
试下16度过夜看看。

试过，也不行。
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在学术的汪洋里，扑腾。
13楼2014-04-14 21:20:26
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by lingsheshidu at 2014-04-13 02:27:30
载体构建连接不上，许多时候是载体片段和目的基因片段有问题，既然你给出了mol比例，说明你对于载体片段和目的基因片段的量是经过测算的，因此问题可能出在酶切/连接环节。你的基因片段是否酶切开了呢？这个问题是与 ...

保护碱基加过了。
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14楼2014-04-14 21:27:58
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 872940890 at 2014-04-14 14:04:01
我现在也是在做表达  
不知道 双酶切 电泳后 你又切胶回收了吗？
有时候  双酶切后电泳会发现  条带弥散  表明DNA已经被降解了

是的，双酶切电泳后又回收了。
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在学术的汪洋里，扑腾。
15楼2014-04-14 21:29:26
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by zhangtao110 at 2014-04-14 15:20:11
如果酶切位点刚好甲基化可能也切不开!

怎么判断酶切位点甲基化？
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16楼2014-04-14 21:30:18
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
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11楼: Originally posted by owl2010 at 2014-04-14 16:22:51
胶回收浓度太低啦，质粒建议回收浓度在30ng/ul 片段10ng/ul 应该可以了，一般都是过夜连接的。你是直接用PCR引物加酶切位点直接扩增做酶切吗？要确定酶切位点上有保护碱基，如果没有的话只能连到T载体上了。
现在有 ...

我的载体回收浓度为6.6ng/ul，目的片段浓度为8.2ng/ul，用的20ul 反应体系，载体加10ul，目的片段加4ul。   
如果按你所说的质粒回收浓度在30ng/ul ，片段10ng/ul ，你是用多大的反应体系呢，载体和片段各加多少ul 呢？
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20楼2014-04-15 10:58:23
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
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17楼: Originally posted by lingsheshidu at 2014-04-14 21:45:44
那就是酶切效率的问题了，可能保护碱基加的少或者不合适，因为PCR产物直接酶切构建载体确实不如先连接T载体容易，原因就是如果保护碱基加的少酶切效率还是较低的。如果你认为保护碱基加的没问题，而且酶切以后也经 ...

我也不确定目的片段是否酶切开，片段738bp，切开也只是少了几个碱基，电泳看不出来。用的是promrga的T4连接酶。
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在学术的汪洋里，扑腾。
21楼2014-04-15 12:21:39
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