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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 目的片段和载体连接一直不上
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段和载体连接一直不上 已有7人参与

1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。
2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。
感谢您的帮助。
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在学术的汪洋里，扑腾。
1楼 2014-04-12 20:46:55
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by owl2010 at 2014-04-14 16:22:51
胶回收浓度太低啦，质粒建议回收浓度在30ng/ul 片段10ng/ul 应该可以了，一般都是过夜连接的。你是直接用PCR引物加酶切位点直接扩增做酶切吗？要确定酶切位点上有保护碱基，如果没有的话只能连到T载体上了。
现在有 ...

我的载体回收浓度为6.6ng/ul，目的片段浓度为8.2ng/ul，用的20ul 反应体系，载体加10ul，目的片段加4ul。   
如果按你所说的质粒回收浓度在30ng/ul ，片段10ng/ul ，你是用多大的反应体系呢，载体和片段各加多少ul 呢？
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在学术的汪洋里，扑腾。
20楼2014-04-15 10:58:23
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for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:27:56
赵晓楠zxn: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-04-14 21:26:18
没长菌算是坏事中的好事，至少没有假阳性，那就调整比例多连几次吧。继续转。
T载体那是因为连接效率高，需要用taq酶进行PCR，是目的基因两端加A，但是同时质量不好的T载体容易形成自连，也就导致假阳性
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操蛋的XX
2楼2014-04-12 20:57:42
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-04-12 20:57:42
没长菌算是坏事中的好事，至少没有假阳性，那就调整比例多连几次吧。继续转。
T载体那是因为连接效率高，需要用taq酶进行PCR，是目的基因两端加A，但是同时质量不好的T载体容易形成自连，也就导致假阳性

应该是连接转化出了问题

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3楼2014-04-12 22:46:37
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淘淘279

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
转化无菌落，有无做阳性对照，不一定是基因与载体没连接的问题

[ 发自小木虫客户端 ]
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你能做的永远不止这些！
4楼2014-04-12 23:06:33
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