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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 目的片段和载体连接一直不上
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段和载体连接一直不上 已有7人参与

1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。
2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。
感谢您的帮助。
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在学术的汪洋里，扑腾。
1楼 2014-04-12 20:46:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lingsheshidu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
赵晓楠zxn(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:28:20
赵晓楠zxn: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-04-14 21:27:35
赵晓楠zxn: 金币+1, ★有帮助 2014-04-14 21:31:09
载体构建连接不上，许多时候是载体片段和目的基因片段有问题，既然你给出了mol比例，说明你对于载体片段和目的基因片段的量是经过测算的，因此问题可能出在酶切/连接环节。你的基因片段是否酶切开了呢？这个问题是与你的第二个问题相关的，之所以有人建议你先连接T载体，是因为PCR产物连接T载体效率相对较高（须用可在PCR产物末端可加A的PCR聚合酶），提取质粒以后再用Nco I和BstE II酶切质粒（此处为关键：酶切质粒的效率一般要远大于酶切PCR产物），回收带粘末端的基因片段再与载体相连。不知你PCR引物设计时，酶切位点外侧是否加了保护碱基呢？如果引物末端只加了酶切位点，而外侧没有加保护碱基，PCR产物是酶切不开的！也就不可能连接上，只能先连接T载体了。
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积累知识，抓紧奋斗！
7楼2014-04-13 02:27:30
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for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:27:56
赵晓楠zxn: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-04-14 21:26:18
没长菌算是坏事中的好事，至少没有假阳性，那就调整比例多连几次吧。继续转。
T载体那是因为连接效率高，需要用taq酶进行PCR，是目的基因两端加A，但是同时质量不好的T载体容易形成自连，也就导致假阳性
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操蛋的XX
2楼2014-04-12 20:57:42
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double可

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确定是否酶失效，T4连接酶在取放的时候都一定要放在冰上。
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早已不承认还有什么神
9楼2014-04-14 14:31:12
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-04-15 11:06:50
1、凝胶回收后损失过多，导致浓度太低，可以增加质粒和pcr的量，体系中少添加水。2、酶切时间短，pcr产物酶切不完全，加长时间，现在的酶特异性挺好的，一般不会乱切，我一般都是切4h。3、连接时间太短，我之前也是室温连了2h，没长，后来16度过夜，就长出来了。
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19楼2014-04-15 09:21:57
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普通回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-04-12 20:57:42
没长菌算是坏事中的好事，至少没有假阳性，那就调整比例多连几次吧。继续转。
T载体那是因为连接效率高，需要用taq酶进行PCR，是目的基因两端加A，但是同时质量不好的T载体容易形成自连，也就导致假阳性

应该是连接转化出了问题

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3楼2014-04-12 22:46:37
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淘淘279

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
转化无菌落，有无做阳性对照，不一定是基因与载体没连接的问题

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你能做的永远不止这些！
4楼2014-04-12 23:06:33
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淘淘279

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:28:10
连T载体是因为用Taq酶做的Pcr末端带A的特性。且其为克隆载体。

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你能做的永远不止这些！
5楼2014-04-12 23:09:51
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
被构建载体伤着了，可是还有9个载体要构

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天道酬勤
6楼2014-04-12 23:46:09
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872940890

铁虫 (小有名气)
我现在也是在做表达  
不知道 双酶切 电泳后 你又切胶回收了吗？
有时候  双酶切后电泳会发现  条带弥散  表明DNA已经被降解了
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我知道我得继续努力！加油！
8楼2014-04-14 14:04:01
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zhangtao110

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果酶切位点刚好甲基化可能也切不开!

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10楼2014-04-14 15:20:11
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