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目的片段和载体连接一直不上 已有7人参与
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1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。 2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。 感谢您的帮助。 |
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lingsheshidu
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赵晓楠zxn(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:28:20
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| 载体构建连接不上，许多时候是载体片段和目的基因片段有问题，既然你给出了mol比例，说明你对于载体片段和目的基因片段的量是经过测算的，因此问题可能出在酶切/连接环节。你的基因片段是否酶切开了呢？这个问题是与你的第二个问题相关的，之所以有人建议你先连接T载体，是因为PCR产物连接T载体效率相对较高（须用可在PCR产物末端可加A的PCR聚合酶），提取质粒以后再用Nco I和BstE II酶切质粒（此处为关键：酶切质粒的效率一般要远大于酶切PCR产物），回收带粘末端的基因片段再与载体相连。不知你PCR引物设计时，酶切位点外侧是否加了保护碱基呢？如果引物末端只加了酶切位点，而外侧没有加保护碱基，PCR产物是酶切不开的！也就不可能连接上，只能先连接T载体了。 |
7楼2014-04-13 02:27:30
for5
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